175045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés sejttenyészet előállítására
15 175045 16-értékét (7,0-7,2). A táptalaj cirkuláltatását 48 órán át folytatjuk. Hagyjuk, hogy a táptalaj felhalmozódjon a hordozóban, amelyet azután kimosunk foszfát puffert tartalmazó fiziológiás sóoldattal, amelyet a hordozó és a közeg tetejére rétegezünk, és lassan levezetjük a folyadékot a hordozó aljáról. Indukáló közeget adagolunk a berendezésbe hasonló módon, amely minimális esszenciális Eagle-féle táptalajt, Earle-sókat, nátriumhidrogénkarbonátot, penicillint/sztreptomicint, 5 /ag/ml ribonukleinsav kettős spirált és 100/ig/ml DEAE dextránt tartalmaz. Hagyjuk, hogy az indukáló közeg két órán át érintkezzen a sejtekkel 37 °C hőmérsékleten, majd az előzőkhöz hasonló módon kimossuk foszfátpuffert tartalmazó fiziológiás sóoldattal. A mosó folyadékot kiszorítjuk a gyűjtő közeggel, amely nátriumhidrogénkarbonát, penicillin/sztreptomicin és 1% magzati marhaszérum adalékanyagokat tartalmazó Eagle-féle táptalaj. A torony tartalmát egy éjszakán át állni hagyjuk 37 °C-on ebben az állapotban, és 3000 NE emberi interferont kapunk. 3. példa Az 1. példában ismertetett eljárás alkalmazásával emberi eredetű fibroblasztokat tenyésztünk az alábbi módon: Politetrafluoretilén aeroszol permettel bevont, 4 mm átmérőjű polikarbonát gyöngyöket henger alakú üvegtoronyba töltünk, úgy, hogy 3,5 cm átmérőjű és 25 cm magasságú hordozóréteget képezzen, majd beoltjuk 8xl06 emberi bőr/izom fibroblaszttal. A sejteket Eagle-féle táptalajjal készített szuszpenzióban visszük fel a hordozóra, amely szuszpenzió Earle-sókat, 10% magzati marhaszérumot, nem-esszenciális aminosavakat, penicillint/sztreptomicint és 0,88 g/liter nátriumhidrogénkarbonátot is tartalmaz. A beoltott hordozót egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A szuszpenziót lassan leürítjük, és megkezdjük a táptalaj cirkuláltatását a cseppfolyós táptalajnak és levegő/széndioxid gázelegynek a habfejlesztő készülékbe történő bevezetésével. A gázelegy mennyiségét úgy állítjuk be, hogy a táptalaj pH-értéke megfelelő (7,0-7,2) legyen. A táptalaj keringtetését 7 5 órán át folytatjuk. Ezután megszüntetjük a gázbevezetést az 1 habfejlesztő készülékbe, és lezárjuk a 19 szelepet. A 10 tartály és az 1 habfejlesztő készülék tartalmát a 12 szelepen keresztül ürítjük le. Ezután lezárjuk a 12 szelepet, és a 10 tartályt megtöltjük a mosóközeggel, amely 0,15 mólos nátriumklorid-oldat, s 7,3-as pH-értéket biztosító foszfátpuffert és 0,1% metil-cellulózt tartalmaz. A mosóközeget habosítjuk, átvezetjük a 2 edényen, végül pedig a 18b csővezetéken és a 20 szelepen keresztül elöntjük. A mosást addig folytatjuk, amíg a sejtekből a vörösszínű táptalaj utolsó nyomait is eltávolítjuk. Ekkor a 20 szelepet lezárjuk, és 37 °C hőmérsékletű tripszin/verzol oldatot vezetünk a 2 edénybe a 15 bevezetésen keresztül, olyan mennyiségben, hogy ellepje a porózus hordozót. 10 perc elteltével a hordozót és az oldatot enyhén rázatjuk 5 percig olyan módon, hogy a 20 szelepen keresztül steril levegő enyhe áramát vezetjük be. A rázatás eredményeként a pufferoldatban szuszpendált sejteket elvezetjük a 2 edényből a 20 szelepen keresztül. A rázatást megismételjük foszfáttal 7,3-es pH-értékűre pufferolt 0,15 mólos nátriumklorid-oldat alkalmazásával. Ezután egy újabb részlet tripszin/verzol pufferoldat, majd sóoldat következik, és mindkettőnél ismét rázatást alkalmazunk az esetleg visszamaradó sejtek eltávolítására. A beoltáshoz használt sejtek száma 8 x 106 Összegyűjtött sejtek (0 a leürített táptalajban és a mosó sóoldatban 0,5 x 106 (ii) az 1. tripszin/verzol kezelésnél 10,7 x 106 (iii) az 1. rázatott mosó só oldatban 1,95 x 10' (ív) a 2. tripszin/verzol kezelésnél 2,48 x 10' (V) a 2. rázatott sóoldatban 4,13 x 10' Összesen 19,8 x 10' 4—101. példa Az előző példákban ismertetett eljárás alkalmazásával különböző emberi fibroblaszt tenyészeteket állítunk elő különféle hordozókban. Az adatokat az I. táblázat tartalmazza. A táblázatban használt rövidítések jelentése a következő: 1000 emberi bőr és izom fibroblasztok 7000 emberi előbőr (fityma) fibroblasztok 12000 emberi orrnyálka hámsejtek meth metil-cellulóz FGF fibroblaszt növekedési faktor PC polikarbonát N6 nylon 6 Nil nylon 11 N12 nylon 12 PET polietilén-tereftalát PET/O/ oxigéntartalmú polietilén-tereftalát PPO polifenilénoxid PP polipropilén PE polietilén PF poliformaldehid FEP fluorozott etilén-propilén kopolimer PTFE politetrafluoretilén S szilikon Sil szilikon DC-Sil szilikon (Dow Corning Silicone 1107) A levegő N nitrogén O/N egy éjszakán át hr óra A hordozók a British Drug Houses Ltd.-től szerezhetők be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
