175045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés sejttenyészet előállítására
3 175045 4 nál alkalmazott ágy azonban a sejteket visszatartó szűrőágyként, és nem nagyfelületű hordozóként szolgál. Hamarosan felismerték, hogy nagy felületű hordozó alkalmazására van szükség a lemezes sejtek tenyésztéséhez [például Experimental Cell Res., 74 571 (1972)]. Korábban, nagy tömegű sejttenyészet előállításához nagy számú edényre volt szükség. Az edények számának csökkentését például összekapcsolt forgó palackok vagy üveglemezeket vagy üvegspirálokat tartalmazó edények használatával kísérelték meg. Ezeknek a megoldásoknak hátránya, hogy gyakran jelentős mennyiségű altenyészet előállítását igénylik, s a berendezés is meglehetősen bonyolult. A fentebb idézett közlemény berendezést is ismertet sejttenyészet előállítására. Az ismert berendezést úgy alakították ki, hogy igen nagy számú sejt tenyésztésére legyen alkalmas minimális kezelési vagy altenyészet-igény mellett. Az ismert berendezés üveggyöngyökkel részlegesen megtöltött, zárt edényből áll. Az üveggyöngyök nagyobbak, mint az 1 436 323 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett, és ezért lényegesen nagyobb felületet biztosítanak. Az ismert berendezés további előnyös jellemzője, hogy belső falai ferdék, és így elősegítik a friss táptalaj egyenletes eloszlását a sejteken. Ezáltal elkerülhetők a táptalaj koncentrációjának szükségtelen ingadozásai a berendezés folyamatos üzeme során. Valamennyi tökéletesített ismert eljárásnál a sejteket folyamatosan ellepi a táptalaj. Ez különösen nagy tömegű tenyészet előállításánál hátrányos, mivel nagy mennyiségű táptalajra van szükség a sejtek beborításához, továbbá rendkívül nehéz azonos pH és p02 viszonyokat fenntartani az egész folyadéktérfogatban. Nagy tömegű tenyészet előállítása során ugyanis könnyen kialakulnak kedvezőtlen pH, p02 stb. viszonyok, amelyek gyenge minőségű és/vagy sérült sejteket eredményeznek. Ismeretes, hogy a lemezes sejtek tenyésztése a leghatékonyabban és a legkisebb veszteséggel úgy történhet, hogy vékony film alakjában vezetik a táptalajt a sejtek monomolekuláris rétegéhez. Eddig ezt az előzőkben ismertetett forgó palackos módszerrel oldották meg, amely jelentős mértékben kiküszöböli a kedvezőtlen pH és p02 viszonyok kialakulását. A forgó palackos módszert nagy számú palack összekapcsolásával alkalmazták nagy tömegű sejttenyészet előállításához, ennek a megoldásnak azonban az a hátránya, hogy minden egyes palackot külön-külön kell beoltani, s ez meglehetősen idő- és munkaigényes művelet, továbbá igen bonyolult a nagy számú palack forgatásához szükséges készülék. Azt találtuk, hogy a táptalaj hab alakjában történő alkalmazásával vékony folyadékfilmet tudunk áramoltatni hordozón elhelyezkedő nagy tömegű sejttenyészethez. Ennek a találmány szerinti megoldásnak számos előnye van:- a szükséges berendezés üzemeltetése egyszerű, — lényegesen kevesebb táptalajra van szükség a sejtek beborításához,- mivel a mátrixon belüli pórusok gázt tartalmaznak, a folyadékfilm feletti gázban a széndioxid/oxigén arány megfelelő megválasztásával azonos PH és p02 érték tartható fenn mindenütt a táptalajban. Ezért jelentősen kiküszöbölődik a tenyészet számára kedvezőtlen körülmények előfordulása, és egyformán egészséges sejtek termelődnek. A találmány szerinti eljárás alapját az a felismerés képezi, hogy a monomolekuláris rétegben elhelyezkedő, különálló sejteket a táptalaj vékony filmjével érintkeztetjük. A találmány szerint a sejtek monomolekuláris rétege szilárd porózus hordozó felületén helyezkedik el, és folyékony táptalajból és gázból előállított habból felszabaduló táptalaj filmmel érintkeztetjük. A sejtek monomolekuláris rétegét a szilárd porózus hordozó legalább egy részére visszük fel, például oly módon, hogy a hordozót a sejtek cseppfolyós közeggel készített szuszpenziójába merítjük be, hagyjuk, hogy a sejtek rárakódjanak a hordozó felületére, majd pedig lecsepegtetjük a szuszpenzió közegét. A táptalajt ezután hab formájában vezetjük a hordozókhoz, olyan sebességgel, hogy megakadályozzuk a hordozó kiszáradását, miközben a sejteket megfelelő fiziológiás hőmérsékleten (azaz 35-38 °C között) tartjuk. Amikor a hab érintkezésbe kerül a hordozóval, szétesik, és vékony film formájában átfolyik a sejtek felületén az egész hordozón, miközben a gáz a pórustérbe kerül. A hordozóról lefolyó táptalajt elöntjük, vagy kívánt esetben visszacirkuláltatjuk. A sejtek tenyésztését addig folytatjuk, amíg a hordozót eléggé nagy monomolekuláris rétegben borítják a sejtek. A sejteket ezután kimossuk a táptalaj eltávolítására, célszerűen habosított mosófolyadékból képződött film alkalmazásával. Ezután a sejteket önmagában ismert módon eltávolítjuk, például tripszinezéssel, kívánt esetben a hordozó egyidejű gyenge rázogatása közben, majd összegyűjtjük. A találmány szerinti eljárást emberi vagy állati eredetű (közöttük emlősöktől, madaraktól, kétéltűektől, halaktól és rovaroktól származó) fibroblasztvagy hámsejtek tenyésztésére alkalmazzuk. E sejtek az in vitro tenyésztés során lemezeket képeznek. A találmány szerinti eljárás segítségével előnyösen emlősöktől, és így az embertől származó bőr és izom fibroblasztok tenyészetét állítjuk elő. A találmány szerinti eljáráshoz alkalmazott hordozó porózus anyag. A hordozó pórustere elegendő nagy kell, hogy legyen: a) a monomolekuláris sejtrétegek elhelyezéséhez, b) annak lehetővé tételéhez, hogy a táptalaj vékony film formájában átfolyhasson a monomolekuláris réteg felületén, miközben a gáz a pórustérben helyezkedik el, és c) a sejtek eltávolításához. A találmány szerint a porózus hordozó felülete megköti a tenyészteni kívánt sejteket, ugyanakkor a tenyésztés befejeztével a sejtek könnyen eltávolíthatók. 5 IC 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 65 11
