174894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinetikus szubsztrátmeghatározásra és reagens ennek kivitelezéséhez
7 174894 8 A vizsgálathoz a Boehringer Mannheim GmbH által gyártott, következő használatra kész reagens-oldatokat alkalmazzuk: 100 mmól/liter 0,77 mmól/liter 11 mmól/liter 3 18 E/ml GOD, ?= 1,1 E/ml POD és 0,9%-os nátriumklorid-oldat. foszfát-puffer, pH = 7,0, 4-amino-antipirin, fenol, Az elemzőkészülék beállítása: 5 10 A normál érték vérben, szérumban, plazmában 70-400 mg/100 ml, illetve 3,89—5,55 mmól/liter. A kalibrálást a Boehringer Mannheim GmbH Precimat Glucose, illetve Precíset Glucose néven kereskedelmi forgalomba hozott termékével, az ellenőrzést ugyancsak a Boehringer Mannheim GmbH Precinorm S, Precipath S és Precilip stb. elnevezéssel kereskedelmi forgalomba hozott termékekkel végezhetjük, utóbbiak meghatározott mennyiségű glükózt tartalmazó szérumok, melyeket ugyanúgy vizsgálunk, mint az elemzendő mintákat. GEMSAEC ROTOLOADER S AMPLE-kapcsoló : BLANK-kapcsoló : a minta térfogata: a minta: nátriumklorid-oldat : a reagens térfogata: a reakciókeverék: + 20, 200 és 1000pl-es B WATER 5 pl (25%)+ 150 pl Í75%)+ 500 pl (50%)+ szivattyúkhoz. GEMSAEC ANALYZER hőmérséklet: előszűrő: hullámhossz: GEMSAEC CONTROL 25 °C 430—560 nm 510 nm 2. példa 15 Trigliceridmeghatározás. A triglicerideket enzimatikusan glicerinre és zsírsavra hasítjuk. A glicerin meghatározása a követ- 20 kező kapcsolt reakciók szerint történik: glicerokináz EC. 2.7.1.30 glicerin + ATP ■ " »glicerin-3--foszfát + ADP piruvátkináz EC 2.7.1.40 25 ADP + foszfoenolpiruvát----------------------------------* ATP + piruvát . laktát-dehidrogenáz EC. piruvát + NADH + H ——----------------------—* 1.1.1.27 laktát + NAD+ 30 Az eljárást kinetikusán a következő reagensekkel valósítjuk meg: a reakciójelleg: üzemelés módja: az első leolvasás (ÍR): a leolvasás intervalluma (Rí): a leolvasások száma (NR): RATE AUTO 10 másodperc 10 másodperc 10 35 Hígítási határ: 40 1000 mg/100 ml, illetve 55,5 mmól/liter. Nagyobb töménységek esetén 500 pl mintát 500 ml 0,9%-os nátriumldorid-oldattal keverünk 45 össze, és a vizsgálatot megismételjük. Az eredményt kettővel szorozzuk. GEMSAEC COMPUTER 50 A számítógépbe betáplált adatok: ÍR = 10 Rí = 10 NR = 10 SC = 100 (illetve 5,55 mmól/liter) 55 KT = (nem alkalmazzuk) TF * 35 TC = 5,0 AD = 4 CD = 0 60 Hl = 100 (illetve 5,55 mmól/liter) LO = 70 (illetve 3,89 mmól/liter) SA = 2 RM = 2 XX = 0 65 1. reagens: 45-55 mmól/liter 4,6—3,1 mmól/liter 300—400 pmól/liter 2,3—3,5 mmól/liter 280—420 pmól/liter 120—230 pmól/liter 7.7 x 104 E/liter 5.8 x 103 E/liter 9,6 x 102 E/liter 5,3 x 103 E/liter 2. reagens 2.9 x 103 E/liter 7,0 pH-jú foszfátpuffer, magnézium-szulfát, nátrium-dodecil-szulfát, ATP, (adenozin-trifoszfát) foszfoenolpiruvát, (PÉP) NADH, (redukált nikotinsavamidadenin-dinukleotid) vagy több lipáz, vagy több észteráz, vagy több piruvátkináz, vagy több laktát-dehidrogenáz. vagy több glicerokináz. A reakciót centrifugál gyors analizátoron 340 nm-nél és 25 °C-on mérjük. Az ATP-koncentráció növelésével a piruvátkináz Michaelis állandója látszólag annyira megnő, hogy a vizsgálatban a glicerin felső határához képest nagy lesz. A többi enzimet túladagoljuk. Ezáltal a piruvátkináz-reakció sebességmeghatározó lesz, és a glicerin-koncentráció a reakciósebességtől meghatározható. A meghatározás kivitelezéséhez 10 pl vizsgálandó szérummintát összekeverünk 30—50 pl fiziológiás konyhasóoldattal és 500-600 pl reagenssel, amely még nem tartalmazza a glicerokinázt, és 10 percig állni hagyjuk. Ezután hozzáadjuk a glicerokinázt, 4
