174894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinetikus szubsztrátmeghatározásra és reagens ennek kivitelezéséhez

9

174894

10

és 50 másodperc múlva elvégezzük az első, 150-200 másodperc múlva a második leolvasást.

A módszer 500—9000 mg triglicerid/liter koncentrációtartományban alkalmazható.

Regressziós arányosság y = 0,99 x + 0,51 Korrelációs koefficiens r = 0,999

2a. példa

Glicerin meghatározása

1. reagens: 50 mmól/liter foszfát-puffer, pH = 7,0, 4 mmól/liter magnéziumszulfát,

0,35 mmól/liter nátrium-dodecilszulfát,

5 2. reagens: 10 mmól/liter NADH,

22 mmól/liter ATP,

18 mmól/liter PÉP,

3. reagens: s 300 E/ml LDH, (laktát-dehidrogenáz) ° s 50 E/liter PK, (piruvátkináz)

S 4000 E/ml lipáz, ís 30 E/ml észteráz,

Az eljárást kinetikusán a következő reagensekkel 4. reagens:

valósítjuk meg: 1. reagens:

15

5. reagens:

45-55 mmól/1

7,0 pH-jú foszfátpuffer,

4,6-3,1 mmól/1

magnézium-szulfát, 20

300—400 pmól/1

nátrium-dodecil-szulfát,

2,3-3,5 mmól/1

ATP,

280-420 pmól/1

foszfoenolpiruvát, (DEP)

120—230 pmól/1

NADH,

9,6 x 102 E/l

vagy több piruvátkináz, 25

5,3 x 103 E/l 2. reagens:

vagy több laktát-dehidrogenáz.

6. reagens:

2,9 x 103 E/l

vagy több glicerokináz. 30

A reakciót centrifugál gyors analizátoron 340 nm-nél és 25 °C-on mérjük. használunk.

^150 E/ml GK, (glicerokináz)

48 mmól/liter foszfát-puffer, pH = 7,0, 3,8 mmól/liter magnéziumszulfát,

0,34 mmól/liter nátrium-dodecilszulfát, 0,2 mmól/üter NADH,

3,0 mmól/liter ATP,

0,35 mmól/liter PÉP,

E/ml LDH, s 1 E/ml PK,

= 77 E/ml lipáz,

= 0,6 E/ml észteráz,

154 mmól/liter nátriumklorid-oldat, ií 2,9 E/ml GK (glicerokináz) valamint

ATP-tablettát (Adenozin-5’trifoszfát) és

0,9%-os nátriumklorid-oldatot

Az ATP-koncentrádó növelésével a piruvátkináz Michaelis állandója látszólagosan annyira megnő, hogy a vizsgálat során előforduló glicerinkoncentráció felső határához képest eléggé nagy. A többi enzimet túladagoljuk. Ezáltal a piruvátkináz-reakció sebességmeghatározó lesz, és a glicerinkoncentráció meghatározható a reakciósebességből.

A meghatározás kivitelezéséhez 100 pl vizsgálandó szérum-mintát összekeverünk 100 pl fiziológiás sóoldattal és 500—600 pl reagenssel, amely még nem tartalmazza a glicerokinázt. Azután hozzáadjuk a glicerokinázt, és 50 másodperc múlva elvégezzük az első, 150—200 másodperc múlva a második leolvasást.

A módszert 50-900 mg glicerin/liter koncentrációtartományban használhatjuk.

35 A 2. jelű reagens-oldatot a palackon levő útmutatástól függően 0,6-5,0 ml desztillált vízben kell oldani. „Start-reagens” céljára 0,2 ml 4 jelű reagens-oldatot 10 ml 0,9%-os nátriumklorid-oldattal hígítunk.

40

Hígítási határ:

500mg/100ml, illetve 5,71 mmól/liter. Nagyobb

45 koncentráció esetén, vagy erősen lipémiás szérumoknál 1 részt 9 rész 0,9%-os nátriumklorid-oldattal hígítunk, a vizsgálatot megismételjük és a kapott eredményt tízzel megszorozzuk.

50 Az elemzőkészülék beállítása:

GEMSAEC ROTOLOADER

Részletes előírások az Electro-Nucleonics Inc. GEMSAEC elnevezésű gyors elemzőkészülékével végzett trigliceridmeghatározáshoz:

A meghatározás a fenti egyenletek alapján történik.

A vizsgálathoz szérum, heparin- vagy EDTA-plazma alkalmazható, mely +4 °C hőmérsékleten 3 napon keresztül tárolható.

A vizsgálathoz a Boehringer Mannheim GmbH által gyártott, következő használatra kész reagensoldatokat alkalmazzuk:

S AMPLE-kapcsoló : 55 BLANK-kapcsoló: a minta térfogata: a minta:

nátriumklorid-oldat : a reagens térfogata: 60 a reagens: startreagens:

C

WATER

10 pl (50%)+ 50 pl (25%)+

500 pl (50%)* 100 pl B-ben++

+ 20, 200 és 1000 pl-es szivattyúkhoz ++ másik reagens-szivattyúval vagy manuálisan du- 65 gattyús pipettával adagolni.

5