174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
17 174891 18 b) PAGAN 149 HD0D-2-G 100 ml 9,8 x 10'6 egységű, 88 mg proteint tartalmazó penicillin-aciláz enzimet 15 g GAN 149 HDOD— 2-vel, 20 ml 0,1 M (pH = 6 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal és 1 ml 2 sólymos nátrium-aziddal hozunk össze, majd 0°C-on homogenizáljuk. Az elegy pH-ját 6,8 értékre állítjuk, 0 °C-on 4.5 órán át tartjuk, ezután 20 000 g értéken 4 °C-on 1 órán át centrifugáljuk. Az üledéket 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal (pH = 7,0) újra szuszpendáljuk, majd ismét centrifugáljuk. Ezt a műveletet egyszer megismételve kapjuk a végső maradékot, amely 11,2 g nedves súlyú. (Tárolása: 4 0 C-on) Specifikus aktivitás: 1,8 x 10'5 mól 6-APS perc-1 g'1 (feltételek az előbbi példával megegyezőek) Visszanyert aktivitás: 55% Flotálható n-dekanollal vagy n-dekánnal. 9. példa Tripszin-(n-decil-amino-GANTREZ AN 119 (TGAN 119 D) lg GANTREZ AN 119-et 5 ml dimetilformamidban oldunk, és erőteljes keverés közben 0,3 g n-decil-amin 1 ml dimetilformamidos oldatát adjuk hozzá. így az oldat viszkózussá válik. 10 perces keverés után az elegyet 22 °C-on hozzácsepegtetjük 300 ml bovin-tripszin 60 ml 0,1 M (pH = 8 értékű) nátrium-foszfát pufferrel készített oldatához. A pH-t 2n nátrium-hidroxid oldattal a fenti értéken tartjuk, és miután további változás már nem következik be, 4 g nátrium-kloridot adunk az elegyhez. A kapott szuszpenziót 175 ml 0,1 M (pH = 7,6 értékű) nátrium-foszfát pufferoldatba öntjük, és 4 °C-ra hűtjük. Az elegyhez 50 g ammónium-szulfátot adunk, és az így kapott keveréket 4 °C-on 20 percig keverjük. Ezután a keveréket 25 000 g értéken 4 °C-on és 1 órán keresztül centrifugáljuk, és a gélszerű üledéket ismét homogenizáljuk 30 ml (pH = 7,6 értékű) 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal. A centrifugálást megismételjük, majd homogenizálás/centrifugálás-ciklust további kétszer megismételjük, és végtermékként 7.5 g laza gélt kapunk. A preparátumot 2 mM N-benzoil-L-arginin-p-nitroaniliddal 0,1 M veronál-pufferoldatban spektrofotometriásán vizsgáljuk (pH = 8,3 értéken) 22 °C-on. Egy egység az extinkció 0,001 értéknyi percenkénti növekedését jelenti 400nm-en. Mivel a gél értékelhető módon fényszóródást okoz, a küvetta időnkénti rázogatása szükséges (lem hosszúságban). I Gél-aktivitása: 168 egység (mg nedves súly) 2000 egység (mg száraz súly) (liofilizált gél) Visszamaradó aktivitás: 24,2%. < A kapcsolt enzim oldószercseppekhez történő tapadását mutatjuk be a következő kísérletben: 1 g nedves súlyú gélt egy kis homogenizátorban 5 2,5 ml n-dekánnal és 10 ml 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal homogenizáljuk, 0 °C-on 5 percen keresztül 4 000 fordulatszámmal. A kapott teljes szuszpenziót 0 °C-on 3 óra után elváasztjuk, a felső fázis a dekán-cseppeket tartalmazza, az alsó 10 pedig a vizes fázist. Mindkét fázist az előzőekben ismertetett spéktrofotometriás módszerrel vizsgáljuk. A felső fázis vizsgálatánál meghatározott időközökben a küvettát ismét rázogatjuk és az extinkció-növekedést méijük. IS A felső fázis aktivitása: 2280 egység/ml Az alsó fázis aktivitása: 57 egység/ml Mivel a felső fázis érzékelt aktivitása jóval kevesebb, mint a valódi aktivitás, ez az eredmény azt jelzi, hogy a tripszin-aktivitás legalább 90%-a az 20 oldószercseppekhez kapcsolódott. 10. példa 25 Penicillin-aciláz (n-oktadecil-amino-Gantrez AN 119) (PAGAN 199 OD) 0,5 g Gantrez AN-119-et 2,5 ml dimetilformamidban oldunk, és vízfürdőn 80 °C-ra melegítjük. 30 Ezután 0,28 g okta-decilamint 2,5 ml dimetilformamidban 80 °C-on oldunk, és gyorsan hozzáadjuk a Gantrez-oldathoz, amely még szintén meleg. Az így kapott elegyet keverjük és 0,1 ml piridint adunk hozzá. Ezután legalább egy óra alatt az elegyet 35 szobahőmérsékletre hütjük le, majd az egész elegyet 175 mg penicillinaciláz 30 ml vizes oldatához adjuk, pH = 7,0 értéken, és 0 °C-on homogenizáljuk. Az ilyen módon kapott rózsaszínű keveréket 40 0 °C-on 3 órán át keverjük a pH-érték fenntartásával, majd 4°C-on végezzük a keverést 16 órán át, ezt követően 5,8 g nátrium-kloridot oldunk a szuszpenzióban, és a kapott elegyet 25 000 g értéken 0 °C-on, 1 órán át centrifugáljuk. A kapott 45 rózsaszínű üledék súlya 4 g. Az üledéket 20 ml 0,1 M (pH = 7 értékű) nátriumfoszfát pufferoldattal újra szuszpendáljuk. 5 súlyszázalékos Penicillin-G-t 20 ml 0,02 M (pH = 7,8 értékű) nátrium-foszfát pufferoldatban 25 °C-on oldva meghatározzuk a 50 szuszpenzió specifikus aktivitását, amely 4,0 x 10"5 mól/perc ml értéknek adódik. Ez az érték azt jelenti, hogy megközelítőleg 70% aktivitás maradt a preparátumban. A fenti 4 ml szuszpenziót 4 000 fordulat/perc mellett 0 °Con 5 percen keresz- 55 tül 20 ml 0,02 M nátrium-foszfát pufferoldattal és 5 ml n-dekanollal homogenizáljuk. A kapott emulziót 100 g értéken centrifugáljuk szobahőmérsékleten 20 percen keresztül, és szétválasztjuk a felső szerves emulziót és az alsó vizes fázist. Az alsó 50 fázist eltesszük, a felső fázist pedig 20 ml 0,02 M nátrium-foszfát-pufferoldattal újra szuszpendáljuk és újra centrifugáljuk. Az első (eredeti) alsó fázis aktivitása 1,25 x 10'5 mól/perc és a felső fázisé 9,5 x 10"5 mól/perc. A fázisok térfogatra számított >5 aktivitás-aránya 21,6 (felső/alsó fázis). Miután a 9
