174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
19 174891 20 fent ismertetett módon az aktivitásokat meghatároztuk, a szerves fázist ismételt centrifugálásnak vetjük alá, eltávolítva a vizes fázisokat. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be. 5. táblázat A PAGAN 119 OD-n-dekanol fázisának aktivitásváltozása az egymás után következő flotációs ciklusokban Ciklusszám Aktivitás% 1 80 2 86 3 93 4 73 5 64 6 47 7 46 8 46 9 44 10 42 11 45 12 43 11. példa Penicillin-adláz (n-dodecil-amino-Gantrez AN 119) (PAGAN 119 DD) 0,25 g n-Dodecil-amino-Gantrez AN 119-et feloldunk 1 ml dimetilformamidban, és 100 mg penidllin-aciláz 14 ml 0,1 M (pH = 7-értékű) nátrium-foszfát pufferoldatához adjuk. A szuszpenziót 0°C-on homogenizáljuk, majd 16 órán keresztül 4°C-on keverjük. Az elegyhez 7,8 g ammonium-szulfátot adunk 4°C-on, és fenntartjuk a 7,0 pH-értéket 1 M nátrium-karbonát-oldat adagolásával. Az ammónium-szulfát feloldódása után egy zavaros szuszpenzió képződik. Ezt 25 000 g értéken 0 °C-on 1 órán át centrifugáljuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk 7,8 g ammónium-szulfát 30 ml vizes oldatával, pH = 7 értéken és ismét centrifugáljuk. A végső termék súlya 1,36 g, amely 10 ml vízben oldva egy viszkózus oldatot ad. Az anyag aktivitása (meghatározás az előző példában végzett módon) 1,62 x 10'4 mól/perc/gramm nedves súly, amely az eredeti aktivitás 80%-át jelenti. A vízoldható kapcsolt enzim n-dekanol cseppeken mutatott stabil-kötődését a következő kísérlettel illusztráljuk: A fenti oldat 1 ml-ét 20 ml 0,02 M nátrium-foszfát pufferoldatban oldjuk és 10 ml n-dekanollal 3 percen keresztül 0 °C-on homogenizáljuk 4 000 fordulat/perc keveréssel. Az emulziót két fázisra választjuk 300 g értéken 10 percig végzett centrifugálással. A felső fázis teljes aktivitása 1,14 x 10~s mól/perc. Az egymás után következő ciklusokkal kapott aktivitás értékeket a 6. táblázat mutatja be. Egy másik kísérletben 2 ml kapcsolt enzimet hasonló körülmények között homogenizálunk 2.5 ml n-dekanollal és 10 ml 0,02 M nátrium-foszfát pufferral. Centrifugálás és az előbbi pufferoldat 20 ml-ével végzett mosás után a felső fázis aktivitása 1,8 x 10-5 mól/perc, az eredeti alsó fázis aktivitása 8,0 x 10"6 mól/perc. A térfogategységre számított specifikus aktivitás-arány közelítőleg 7.5 (felső/alsó fázis). 6. táblázat A PAGAN 119 DD-n-dekanol fázis kezdetihez viszonyított aktivitása az egymás után következő ciklusokban Ciklusszám Aktivitás% 1 96 2 66 3 66 4 53 12. példa Tripszín-(hidrolizált n-oktadecil-amino-GANTREZ AN 149) (TGAN 149 DCMC) 15 g duzzasztott polimer .gélt 0,1 M (pH = 7 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal keverjük, majd 2n sósavoldattal a pH-t 4,7-re állítjuk. Az oldathoz 0,5 g l-dklohexil-3-(2-morfolino-etil)-karbodiimid-meto-p-toluol-szulfonátot adunk, és a pH-értéket 2n sósav-oldat adagolásával 4,7-es értéken tartjuk. 5 perc eltelte után szobahőmérsékleten 75 mg bovin-tripszin 2 ml 0,1 M (pH = 7 értékű) nátrium-foszfát pufferrel képzett oldatát adjuk az elegyhez. A reakcióelegy pH-ját 5,9-re állítjuk, és több mint egy órán át ezen a pH-értéken tartjuk 2n nátrium-hidroxid adagolásával. Szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, azután a gélt 25 000 g értéken 4 °C-on 30 percen keresztül centrifugáljuk. A terméket 40 ml 0,1 M (pH = 7 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal újra szuszpendáljuk és újra centrifugáljuk. Az így kapott terméket 15 ml fenti pufferoldat és 10 ml n-dekán elegyével homogenizáljuk. Ez az eljárás tökéletlen diszperziót szolgáltat. Ezért a keveréket 20 KHz frekvenciájú ultrahanggal 5x5 percig kezeljük, a kezelés meg5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
