174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
23 174891 24 gatnyi metil-izo-butil-ketont adunk hozzá. A pH-t 4,3-ra csökkentjük koncentrált salétromsavval, amikor is a 6-APS kicsapódik. A szilárd részt szűréssel eltávolítjuk, a csapadékot vízzel és acetonnal mossuk, majd egy éjszakán át 40 °C-on szárítjuk. A fenti módon 7,65 g 6-aminopenicillánsavat (6-APS) kapunk. 15. példa Brináz (n-dodecilamino-Gantrez AN 119) (BRGAN 119 DD) 0,5 g n-dodecilamino-Gantrez 119-et feloldunk 2,5 ml dimetilformamidban, és az oldatot hozzáadjuk 0,2 g Brináz (Aspergillus oryzae-ből származó lúgos proteáz) 30 ml 0,1 M nátriumfoszfáttal (pH = 8,0) készített oldatához, és a keveréket homogenizáljuk. A keverést 18 órán át folytatjuk 4 °C-on majd 2,0 g glicint és 20 ml vizet adunk a reakcióelegyhez, és a keverést még 1 órán át folytatjuk 4 °C-on< Ekkor a reakcióelegyhez nátriumkloridot adunk a 4 M koncentráció eléréséig, majd 4 °C-on 1 órán át keverjük tovább a reakcióelegyet, végül 4 °C-on 1 órán át centrifugáljuk 20 000 g értéken. A kapott üledéket 20 ml vízben újra oldjuk, és a kicsapást megismételjük. Ekkor 1,26 g nedves súlyú terméket kapunk, amelyet 10 ml 0,1 M nátriumfoszfátban (pH = 7,0) oldunk. Az így kapott termék specifikus aktivitása 1220 egység/ml. A vizsgálatot SBGAN 119 DD-re végeztük. A termék fibrinnel szemben is aktív. 16. példa Ureáz (n-dodecilamino-Gantrez AN 119) (UGAN 119 DD) 0,2 g n-dodecilamino-Gantrez AN 119-et feloldunk 1,0 ml dimetilformamidban, és az oldatot hozzáadjuk 50 mg Jack Bean ureáz 7,5 ml 0,1 M nátriumfoszfáttal (pH = 8,0) készített oldatához, majd a kapott elegyet homogenizáljuk. Ezután hozzáadunk újabb 12,5 ml puffert, és a keverést tovább folytatjuk 4°C-on 16 órán át. További 5.0 ml puffer hozzáadása után 9,0 g ammóniumszulfátot adunk a reakcióelegyhez, a keverést 1 órán át folytatjuk 4 °C-on, azután a reakcióelegyet 45 percig centrifugáljuk 4 °C-on 20 000 g értéken. A kapott üledéket 20 ml foszfátpufferben újra szuszpendáljuk, 2 órán át keverjük 4 °C-on és 5.0 g nátriumklorid hozzáadásával megismételjük a kicsapást. A terméket centrifugálással különítjük el. 0,943 g nedves súlyú terméket kapunk, amely az eredeti aktivitás 28%-át tartalmazza. A vizsgálatot karbamid titrimetriás hasításával végezzük karbamidnak 0,1 M nátriumfoszfáttal készített 7,0 pH-jú 0,05 M koncentrációjú oldatában 38 °C-on. 5,75 nemzetközi egység konjugátot 5,0 ml 0,1 M nátriumfoszfátban (pH = 7,0) 2,0 ml vízzel-nem-elegyedő oldószerrel homogenizálunk. A felső fázist centrifugálással elkülönítjük és megvizsgáljuk. Oldószer Teljes aktivitás % a felső fázis cseppecskéiben n-dekán 43,4 n-dekanol 82,5 glicerin-trioleát 75,6 17. példa Szubtilizin (n-dodecilamino-Gantrez AN 119) (SBGAN 119 DD) 2,0 g n-dodecilamino-Gantrez AN 119-et 10 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot hozzáadjuk 0,2 g Subtilisin Carlsberg 100 ml 0,2 M nátriumfoszfáttal (pH = 9,0) készített oldatához, és a reakcióelegyet homogenizáljuk, majd 4 °C-on keverjük 16 órán át, hozzáadjuk 0,5 M glicinhez, és pH-ját 8,0-ra állítjuk be. 1 órán át állni hagyjuk 4 °C-on, azután 2,0 M koncentráció eléréséig nátriumkloridot adunk hozzá, és 1 órán át centrifugáljuk 4 °C-on 25 000 g értéken. A kapott üledéket 75 ml 0,05 M nátriumfoszfátban (pH = 7,0) oldjuk, és megismételjük a kicsapást. A kapott terméket, amelynek nedves súlya 7,2 g, 36 ml vízben oldjuk. Az így kapott termék az eredeti aktivitás 30%-át tartalmazza. Az előbbi kicsapások során kapott felső fázisokat összegyűjtjük, pH-jukat 2,0-ra állítjuk be, és 30 percig centrifugáljuk 4°C-on 15 000 g értéken. Az üledéket 20 ml 0,2 M nátriumfoszfátban (pH = 7,0) oldjuk. Az így kapott termék az eredeti aktivitás 11%-át tartalmazza. A vizsgálathoz 3 x 10“5 M p-nitrofenil-fenüacetátot használtunk 0,1 M Veronáiban. (2,5 ml, pH = 8,3). A p-nitrofenol felszabadulását spektrofotometriásán mértük 25 °C-on 402 nm értéken 1 cm úthosszái. 1 egység = 10-3 O.D perc-1. A nátriumkloriddal kicsapott termékből a nedves súlyra számítva 1 súly/térf.%-os oldatot készítünk 10 ml 0,1 M nátriumfoszfáttal (pH = 7,0), és n-dekán 2,0 ml-es frakcióval extraháljuk homogenizálás és enyhe centrifugálás mellett. Minden ciklusban megvizsgáltuk a vizes fázis maradék aktivitását. Az alábbi eredményeket kaptuk. Az extrakció száma Aktivitás egység/ml 0 350 1 270 2 195 3 157 4 75 5 60 6 40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
