174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
25 174891 26 18. (összehasonlító) példa n-Hexilamino-Gantrez AN 119 Ebben a példában egy az 1 284 925 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás 2. példája szerint előállított vízoldható komplexet hasonlítunk össze egy találmány szerinti komplexszel (az alább említendő B komplexszel) abból a szempontból, hogy mennyire választhatók el ezek a komplexek vizes közegből, ha azt egy vízzel nem-elegyedő folyadékkal érintkeztetjük. A kísérletet úgy végez- 10 tűk, hogy a komplexeket vízben diszpergáltuk, megmértük az enzim-aktivitást, a vizes készítményt egy vízzel-nem-elegyedő folyadékkal homogenizáltuk, majd az enzim-aktivitást újra meghatároztuk a vizes fázistban. 1. Módszer és anyagok A vizsgálathoz penicillin-acilázt használtunk. A vizsgálatot spektrofotometriásán végeztük 20 25 °C-on, melyhez p-nitrofenil-fenilacetát 0,1 M veronálpufferrel (pH = 8,13) készített 4x 10”5 M koncentrációjú oldatát használtuk. A reakciót ezzel a módszerrel 405 nm-nél követtük. 1 NPPA egység 10”3 perc-1 változást idéz elő az abszorpcióban. 25 1,56 g Gantrez AN 119-et feloldunk 10 ml vízmentes piridinben. 0,337 g n-hexilamint felol- 5 dunk 5 ml piridinben, az oldatot 40 °C-ra melegítjük fel, és keverés közben hozzácsepegtetjük a polimer oldatához. A kapott rózsaszínű folyadékot 16 órán át keverjük 22 °C-on, azután bepároljuk. A rózsaszín gyantaszerű maradékot vízmentes dimetilszulfoxidban újra feloldjuk, és a 10 ml térfogatú oldatot szobahőmérsékleten félretesszük. n-Hexilamino-Gantrez AN 119 penicillin-aciláz konjugát (B) Az előbbi polimer oldat 2,0 ml-ét hozzáadjuk részlegesen tisztított aciláz 0,05 M TrienHCl-es oldatának (pH = 8,0) 10 ml-éhez, és egy percenként 2000 fordulatszámú szövetőrlő berendezéssel homogenizáljuk 1 percig 22 °C-on. A kapott habot 3 órán át keverjük 4 °C-on, és hozzáadunk 6,2 g szilárd ammóniumszulfátot. Ekkor egy gyantaszerű anyag válik ki. Ezt elkülönítjük és 10 ml 0,1 M TrienHCl (pH = 8,0) oldatban oldjuk. A konjugát az eredeti aktivitás 48%-át tartalmazza. Diaminohexil-Gantrez AN 149-penicillin-adláz (Az 1 284 925 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás 2. példája) (A) 1,0 g Gantrez . AN 149-et 4°C-on összekeverünk 100 ml 0,2 M nátriumfoszfát pufferrel (pH = 7,4). 3 perc múlva 5,0 ml (7,5 x 10s NPPA egység) részlegesen tisztított penicillin-aciláz oldatot adunk hozzá, és az elegyet 3 órán át keverjük 4 °C-on. 35 Ezután hozzáadjuk 0,1 g 1,6-diaminohexán 10 ml vízzel készített oldatát, és a keverést 24 órán át folytatjuk tovább 4 °C-on. A vizsgálat szerint a komplex aktivitása 6625 NPPA egység/ml. (100%-os kihozatal). Ezt az anyagot további tisztítás nélkül 40 használtuk. 2. Elválasztási kísérlet Az A és B oldatot 10 m 0,2 M nátriumfoszfát- 30 tál (pH = 7,4) hígítjuk és a hígított oldatot a) 2,0 ml n-dekán és 0,5 ml n-dekanol elegyével vagy b) 4 ml n-dekanollal homogenizáljuk egy percenként 4000 fordulatszámú keverőberendezésben 1 percig szobahőmérsékleten. A homogenizátumot 5 percig centrifugáljuk szobahőmérsékleten 1000 g értéken. Az alsó vizes fázist vizsgáljuk. 3. Eredményeinket az alábbi táblázatban foglaljuk össze: Enzim Vízzel-nem-elegyedő folyadék Aktivitás a homogenizálás előtt NPPA/ml homogenizálás után A szétválás foka % A dekán-dekanol 720 720 0 dekán-dekanol 480 540 0 dekán 392 404 0 B dekán-dekanol 1160 800 31 dekán-dekanol 620 440 29 dekanol 550 350 36 4. Amint az előbbi táblázatból kitűnik, az A 55 komplex nem választható el a vizes közegből, amikor azt vízzel rem-elegyedő folyadékkal érintkeztetjük. Ezzel szemben a B komplex elválasztható ezen az úton. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel, azzal jellemezve, hogy az 65 enzim szubsztrátját vizes közegben érintkeztetjük egy olyan enzimkészítménnyel, amely vízzel-nem-elegyedő közömbös folyadékhoz kapcsoló apoláros csoportokat tartalmaz az enzimhez kötve - előnyösen lipáz, penicillin-aciláz, tripszin, brináz, ureáz vagy szubtilizin a készítmény enzim-része -, a vizes reakcióelegyet egy vízzel-nem-elegyedő közömbös folyadékkal — előnyösen egy alkánnal, egy aromás szénhidrogénnel, egy nagyobb szénatomszámú alifás észténél vagy egy 4-12 szénatomos alifás alkohollal - érintkeztetjük, majd a reakció 13
