174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
3 174887 4 Acad, of Sei., 27, 1003 (1965)], továbbá Punsalang és Sawyer. A Brinton-féle módszer Escherichia coli szálak tanulmányozására lett kifejlesztve. Vizsgálataink során megkíséreltük megismételni Buchanan és munkatársai munkáját, és azt tapasztaltuk, hogy az idézett közleményben leírt műveletek semmiképpen nem szolgáltatnak Neisseria gonorrhoeae szálakat. Részletes tanulmányt állítottunk össze és készítettünk elő kiadásra, amelyben összehasonlítjuk Buchanan munkáját a jelen találmány feltalálóinak eredményeivel. A Buchanan és munkatársai által alkalmazott módszerek és a találmány szerinti eljárás összehasonlításából kiderül, hogy Buchanan, valamint Punsalang és Sawyer módszerei valóban kitűnően célozták meg a GC szálak eltávolítását, és ha véletlenül Buchanan termékénél immunreakció következik be az állítólagos szál anyagra, azt az alkalmazott módszer kezdetlegességének vagy hibájának kell tekinteni. Bejelentő tudomása szerint a jelen találmány benyújtása idején Buchanan elismerte eljárásának hibáit, jóllehet nyomtatásban még nem jelent meg semmilyen visszavonás. A találmány szerint a Neisseria gonorrhoeae organizmusok T\ és T2 típusú tisztított szálait, valamint ezek TR alvariánsait állítjuk elő, kívánt esetben kristályos alakban (a továbbiakban GC szál kristályok). A GC szálakat vagy az organizmus felületi tenyészetéből, vagy süllyesztett folyadék tenyészetéből különítjük el. A Neisseria gonorrhoeae sejtek felületi vagy süllyesztett folyadék tenyészetét önmagában ismert módon készítjük el. A süllyesztett módszer módosításaként nagy felületű, közömbös közeget adunk a tenyészethez a tisztítás elősegítésére. Erre a célra a diatomaföldet (például celit) találtuk alkalmasnak. Felületi tenyészet esetén a teljes tenyészetet, azaz a sejteket és a szálakat eltávolítjuk a táptalajból, és vizes közegben szuszpendáljuk egy előre meghatározott, 9,2 alatti pH-értéken. Ha csupán a T2 szálakat kívánjuk elkülöníteni, bármilyen 5,5 és 9,2 közötti pH-érték alkalmas. Abban az esetben, ha a Ti szálakat kívánjuk elkülöníteni, vagy önmagukban, vagy a T2 szálak jelenlétében, 7.7 alatti, célszerűen 7,9 korüli pH-érték szükséges. Süllyesztett táptalajban előállított tenyészet esetén ilyenfajta szuszpendálás nem szükséges. Azt találtuk, továbbá, hogy a szál kristályok oldhatók 4,5 alatti pH-értéken, és lényegében ismét kialakulnak, ha a pH-t a fenti érték fölé növeljük, feltéve, hogy előzetesen nem csökkentettük 2,5 körüli pH-érték alá. A szuszpenzióknak az oldható részét elválsztjuk az oldhatatlan szuszpenziórészektől. Az elválasztás szűréssel is történhet, általában előnyös azonban centrifugálás alkalmazása. A centrifugálással kapott tiszta folyadékot (illetve szűrés esetén a szürletet) elöntjük, és a maradékot dolgozzuk fel a továbbiakban. A tisztítás következő lépésében oldatba visszük a gonococcus szálak összetevőit, és elkülönítjük a visszamaradó anyagtól. Felületi tenyészet esetén ez az anyag egész sejteket és törmeléket tartalmaz, süllyesztett tenyészet esetén pedig még nagy fajlagos felületű anyag, például celit is jelen van. A gonococcus szál kristályok feloldását két különböző, de egymással rokon módszer alkalmazásával érhetjük el. A GC szál kristályok anyagának feloldásakor felhasítjuk a szálon belüli nem-kovalens kötéseket, amelyek magukba foglalják a szálak fő részét képező peptid anyagot, ugyanakkor érintetlenül hagyjuk a kovalens kötéseket. Más szavakkal, olyan szolubilizáló szert alkalmazunk, amely nem denaturálja a pepiidet, hanem mindössze pálcikákra bontja szét a kristályokat. A szolubilizáló szer lehet a pH-tól független anyag, például vizes karbamid, annyi víz, hogy a vizes szuszpendáló közeg ionkoncentrációja 0,002 M alá csökkenjen, elegendő só, célszerűen alkálifémek és alkáli földfémek ásványi savakkal képezett sói, hogy az ionerősség 4,4 feletti értékre növekedjen, karbamid 3—5 M közötti koncentrációban, és annyi szacharóz, hogy a koncentráció 50 vegyes % felett legyen. A szál kristályok újra kiválnak, ha az ionerősséget körülbelül 0,05 feletti értékre növeljük ásványi savak alkálifém- vagy alkáli földfémsói hozzáadásával, annyi víz hozzáadásával, hogy 0,5 alatti ionerősségűre csökkenjen a sókoncentráció, annyi pufferoldat, célszerűen trisz[trisz(hidroximetil)-aminometán] puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat hozzáadásával, hogy közepes ionerősség (0,05—0,5) álljon be 4,5-9,2 közötti pH-értéken, illetve annyi víz hozzáadásával, hogy az említett szacharóz-koncentráció 50 vegyes %-ról 40 súly% alá csökkenjen. A szolubilizáló szerek a pH-tól is függhetnek, mint például a bázikus pufferek. így a írisz puffer a pH-értéket 9,3-ról 11-re növeli a í2 szálaknál, és körülbelül 7-ről 8,6-ra a T, szálaknál. Ennek a tartománynak az alsó értékét az oldhatóság kezdete, a felső értékét pedig a denaturalás veszélyének kezdete határozza meg. Megfigyeltük azonban, hogy még abban az esetben is, ha a GC szál kristályok olyan mértékben denaturálódnak, hogy a szálak nem kristályosodnak újra, lényegében nem szenvednek kárt az antigén jellemzőik. Miután hozzáadjuk a szolvatáló közeget a fentebb említett szilárd maradékhoz, ismét elválasztjuk ennek a második szuszpenziónak az oldható és oldhatatlan részét. Ugyanúgy, mint korábban, ez az elválasztás is szűréssel vagy centrifugálással történhet, célszerűen azonban centrifugálást alkalmazunk. A centrifugálásos módszer lehet egyszerű vagy módosított. Az egyszerű centrifugálásos módszernél a szuszpenziót kis sebességű centrifugában kezeljük, a folyadék tisztáját megtartjuk, és a maradékot félretesszük. Ha növelni kívánjuk a kitermelést, a maradékot ismét felszuszpendáljuk, újra centrifugáljuk, a maradékot eldobjuk, a folyadék tisztáját pedig az előzővel egyesítjük. Az egyesített oldatokat ezután nagy sebességű centrifugálásnak vetjük alá a maradékban jelenlevő kis törmelékek utolsó nyomainak eltávolítására. A folyadék tisztáját félretesszük az ezt követő leválasztási lépésben való felhasználáshoz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
