174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
5 174887 6 A módosított centrifugálásos eljárásnál a szolubilizált szálakat, azaz vagy a nagy pH-értékű szuszpenziókat, vagy azokat, ahol a nem-kovalens kötések felhasítására vizes közegben jelenlevő szolubilizáló szert, például karbamidot használtunk, vizes céziumklorid-oldattal elegyítjük. Tekintettel arra, hogy a céziumklorid-grádiens módszer magába foglalja a centrifugálást, nem szükséges a törmelékek teljes eltávolítása, azonban tisztább eredményt kapunk előszűrés vagy előcentrifugálás alkalmazásával. A céziumkloridos elegyet ezután centrifugálásnak vetjük alá, a szokásos módon, elválsztva a céziumkloridot és megmérve az abszorpciót különböző sűrüséggrádiens értékeknél. A célszerűen 280 nm-nél mért fő maximum elhelyezkedése a szál oldat elhelyezkedését jelzi. Valamelyik centrifugálásos módszert alkalmazzuk, majd a szál oldatot tartalmazó vizes frakciókat olyan módon kezeljük, hogy kicsapódjanak a szál kristályok. Ezt úgy érhetjük el, hogy arra a pH-értékre csökkentjük a lúgosságot, amelyről megnöveltük, vagy eltávolítjuk a nem-kovalens kötést felhasító anyagot, a céziumkloridot, vagy lecsapószert, például ammóniumszulfátot adunk hozzá. Lecsapási körülményeket dialízissel vagy közvetlen hozzáadással hozhatunk létre. Ha csökkentjük a pH értékét és eltávolítjuk a kötést felhasító anyagot, kialakulnak a GC szál kristályok, amelyeket ezután szűréssel vagy előnyösen kis sebességű centrifugálással különítjük el a vizes közegből. A folyadék tisztáját elválasztjuk, és az így kapott GC szál kristályokat, ha szükséges, csökkentett nyomáson megszárítjuk vagy megfelelő vizes közegben tároljuk. Jóllehet célszerű a kristályok alacsony hőmérsékleten és steril közegben történő tárolása, ez nem elengedhetetlen, tekintettel a bakteriális szennyezés távollétében fennálló stabilitásukra. Megjegyezzük, hogy a szál kristályok ténylegesen nagy molekulasúlyú, különálló pálcikák agglomerációi. Ennek következtében, ha a szolubilizált szálakat tartalmazó közeget nagy sebességű centrifugálással tisztítjuk, kívánt esetben kispórusú (célszerűen 0,45 mikron méretű) szűrőn történő átvezetéssel végrehajtott sterilizálással egybekötve, az egyes szál pálcikák kiválhatnak az ultracentrifugálás hatására [célszerűen 40 KG feletti intenzitású centrifugálásnál (1 KG a gravitáció folytán ható erő ezerszeresének megfelelő centrifugális erő)]. Abban az esetben, ha nincsen szükség rendkívüli tisztaságú szálakra, akkor egy gyors és rövidített tisztítás is megfelelő. Ennél az eljárásváltozatnál az egész gonococcus tenyészetet átvisszük egy nagy pH-értékű pufferbe, amely célszerűen etanolamin puffer, és a pH értéke előnyösen a szóbanforgó Î! vagy T2 változat oldódási pontja felett van, célszerűen 10,0 körül, a teljes oldódás biztosítására, majd a szilárd részecskéket szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk, és a pH értékét lecsökkentjük - célszerűen, de nem feltétlenül dialízissel. Ha például a pH értékét 8,6-ra állítjuk be, akkor először a T2 szál kristályok válnak ki, és a pH-érték 7,7 alá történő csökkentésekor kristályosodnak a T! szál kristályok. Ez egyetlen műveleti lépésben jelzi a szóbanforgó változat típusát, ami csak a biztonság kedvéért szükséges, hiszen egy gyakorlott bakteriológus a telepek alapján különbséget tud tenni a két változat között Alternatív módon a GC szál kristályokat ammóniumszulfát hozzáadásával is leválaszthatjuk. (A szobahőmérsékletre vonatkozó) telítettség 4—7%-a közötti anion-koncentráció esetén a T2 szálak válnak ki kristályosán, míg a telítettség 5—10%-a között a Ti szálak válnak ki. A GC szálaikat nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél-elektroforézisnek vethetjük alá, és ekkor egy fő sávot és egy kisebb sávot kapunk. A fő sáv, amelyet a továbbiakban „GC pilin”-nek nevezünk, azt mutatja, hogy foszforglikoproteint tartalmaz. Vizsgálataink során továbbá megállapítottuk, hogy a T2 GC pilin tartalmaz egy peptid részt, amely 200 ± 9 aminosavból áll, 2 vagy 3 foszfát-csoportot, 1-2 hexóz cukrot, gyakorlatilag oldható vizes közegben 10,1 feletti pH-értéken, és lényegében oldhatatlan 8,6 alatti pH-értékű vizes közegben, ahol mindkét pH-értéket 20 °C-on mérjük. A T2 GC szálak fő anyagának, a T2 GC pilinnek a molekulasúlya, nátrium-dodecil-szulfát akrilamid gél-elektroforézissel végzett meghatározás alapján 21 500 ± 1000 dalion. A Ti típusú Neisseria gonorrhoeae tenyészetből izolált GC szálak immunológiailag rendkívül hasonlók a T2 típusú Neisseria gonorrhoeae tenyészetből elkülönített GC szálakhoz. Összehasonlításképpen, a T! típusú GC szálak gyakorlatilag oldhatók vizes közegben 8,5 pH-érték felett, és gyakorlatilag oldhatatlanok 7,7 alatti pH-értékű vizes közegben, ahol mindkét pH-értéket 20°C-on mérjük. A Ti típusú GC púin molekulasúlya a nátrium-dodecil-szulfát akrilamid gél-elektroforézissel végzett meghatározás alapján 22 000 ± 1000. Több mint 20 különböző Neisseria gonorrhoeae törzs tenyészetéből izoláltunk GC szálakat. Ha a kísérleti állatokba akár GC szál kristályokat, akár különálló pálca szálakat, akár nátrium-dodecil-szulfát akrilamid gél-elektroforézissel kapott eluátumot fecskendeztünk be, antitestek képződtek a kísérleti állatok szérumában. Ha GC szál kristályokat önmagukban vagy alkalmas szuszpendáló közegben olyan szérummal kezelünk, amely a fenti antitesteket tartalmazza, a kristályok agglutinálódnak. Ez az agglutinálódás a legkönnyebben sötétmezős mikroszkóppal figyelhető meg, azonban más módon is észrevehető, s ilyen módon egyszerűen és azonnal kimutatható a vizsgálati szérumban az antitestek jelenléte. Ez a teszt módszer többek között a következő célokra használható fel: gonorrhea-szűrés a beteg egyének kiválogatására, akiknél azután a kórokozót kitenyésztik, a nagy veszélyforrást jelentő újonnan fertőzött betegek elkülönítése a krónikusan fertőzöttektől, az esetleges helyi járványt okozó törzs és bizonyos tünetekért felelő törzsek azonosítása. Megjegyzendő, hogy jóllehet a teszt segítségével meghatározhatjuk a vizsgálati mintában a GC szálak antitestjeinek jelenlétét, nem állapítható meg közvetlenül, hogy az a személy, akitől a vérszérum mintát vették, aktív gonorrheában szenved-e, vagy 5 IC 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
