174883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén kinyerésére és az antigént tartalmazó reagenskészítmény előállítására
174883 12 Államok-beli cég Amicon márkanevű, üreges rost alkalmazásán alapuló rendszerével végezzük, amelynek lényege az, hogy a szűrendő folyadékot nyomás alatt üreges rostokon nyomatjuk át, amikoris a rost külseje és belseje közötti hidrosztatikus nyomásban levő különbség a rostok pórusainál kisebb méretű folyadékot és anyagokat a roston át távozni kényszeríti, és így a rostok belsejében folyó folyadékot koncentrálja] útján, ezután pedig tovább töményítünk látszólagos szárazságig polietilénglikol 6000 anyaggal [gyártja a Fisher Scientific Company (Pittsburgh, Pennsylvania állam) Amerikai Egyesült Államok-beli cég] szembeni dializáiás útján. A dialízisnél használt szűrőzsákokat alaposan átöblítjük, majd 3,6 pH-jú 0,1 mólos nátrium-acetát-ecetsav pufferbe helyezzük az antigén újrahidratálása és kicsapása céljából. E művelethez annyi ilyen puffert használunk, hogy a szűrőzsákokban maradt szilárd anyag teljes mennyisége szolubilizálódjék. Centrifugálás után az így elkülönített antigént olyan mennyiségű 8,5 pH-jú 0,05 mólos t risz-(hidroxime til)-aminometán-pufferrel szolubilizáljuk, amennyi a teljes anyagmennyiség szolubilizálásához szükséges. Miután az előzőekben ismertetett módon ultraszűrés útján mintegy hetvenszeres koncentrálásnak vetettük alá, a tenyészetből a sejtek elkülönítése során kapott felülúszó fázist szárazra dializáljuk polietilénglikol 6000 jelzésű anyaggal szemben. A dialízisnél használt szűrőzsákokat 6—8-szor 10 liternyi 0,1 mólos nátrium-acetát-ecetsav pufferbe helyezzük, tartalmuk részleges hidratálására és az antigén kicsapására. Az üledéket ezután centrifugálás útján eltávolítjuk, majd 10-szeres térfogatú 1 mólos, 0,1 mól dínátrium-hidrogén-foszfátot tartalmazó és 8,8 pH-jú kálium-kloriddal extraháljuk. A felülúszó fázist sósavval 3,6 pH-ra savanyítjuk, majd az így kicsapott antigént centrifugálás útján elkülönítjük. Az antigént ezután 8,5 pH-jú 0,1 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometán-pufferrel szolubilizáljuk, a puffert a teljes anyagmennyiség szolubilizálásához szükséges mennyiségben véve. A sejtekből és a tenyészetből kapott felülúszó fázisból elkülönített antigéneket — trisz-(hidroximetil)-aminometánnal szolubilizált formában - egyesítjük, majd pepszines lebontásnak vetjük alá. Az antigén-oldat pH-ját 3,2-re csökkentjük 12 n sósavoldat adagolása útján. 56 ml antigén-oldathoz (280 mm-nél mérve 36 optikai sűrűség egység) ezután 10 mg pepszint [gyártja a Worthington Biochemicals (Freehold, New Jersey állam) Amerikai Egyesül Államok-beli cég, aktivitása 2500 egys.ég/mg] adunk 1 mg/ml töménységű 0,2 mólos ecetsavas oldat formájában, majd az így kapott elegyet 36°C-on 1,25 órán át inicubáljuk. A lebontást úgy szakítjuk meg, hogy a reakcióelegyhez pH-jának 8,5-re való beállásáig 10 n nátrium-hidroxid-oldatot adagolunk. A pepszin inaktiválását követően a lebontásnak alávetett antigén-oldatot 1 :1 arányban 8,5 pH-jú 0,05 mólos tri$z-(hidroximetil)-aminometán-pufferrel hígítjuk. Az így kapott antigén-oldat felhasználható a találmány szerinti antigén-reagenskészítmény előállításában. 11 2. példa Neisseria gonorrhoeae antigén előállítása a táptalajból A formaiinnal elölt és konzervált sejteket centrifugálás útján eltávolítjuk a fermentléből, majd a felülúszó fázisból 50 litert százszorosára töményítünk ultraszűrés útján. A koncentrátumot ezután 0,85%-os nátrium-klorid-oldattal szemben dializáljuk, majd a térfogatot ultraszűrés útján 500 ml-re állítjuk be. Ezután a pH-t 5,2-re állítjuk be, majd a kivált csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük. A csapadékot ezután 100 ml 8,5 pH-jú trisz-(hidroximetilj-aminometán-puffer’oen újra szuszpendáljuk. 3. példa In vitro felhasználható, Neisseria gonorrhoeae antigént tartalmazó reagenskészítmény előállítása Az 1. példában ismertetett módon sejtekből, illetve a tenyészetből kapott felülúszó fázisból extrahált antigéneket összeöntünk, majd koleszterin-lecitin részecskéken adszorbeáltatunk az alábbiakban ismertetett módon. Laposfenekű tartályban 160 fordulat/perc sebességgel forgatott 130 ml szolubilizált antigénhez 0,9% koleszterint [szállítója a Pfansteihl Laboratories, Inc. (Waukegan, Illinois állam) Amerikai Egyesült Államok-beli cég] és 0,225% tojás-lecitint [szállítója a Lee Laboratories (Grayson, Georgia állam) Amerikai Egyesült Államok-beli cég] tartalmazó, vízmentes etanolos oldatból 130 ml-t adunk cseppenként. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 15 percen át inkubáljuk. Ezután a kicsapódott pelyhes anyagot 4 °C-on 0,5 órán át 3000 g sebességgel végzett centrifugálás útján pelletezzük. A pelyhes csapadékot ezután 1040 ml USR jelzésű pufferben (125 ml 0,1 mólos etiléndiamin-tetraecetsav-oldat, 250 ml 40%-os kolin-klorid-oldat, 500 ml 0,02 mólos, 6,9 pH-jú és 0,2% timerozalt tartalmazó foszfát-puffer és 125 ml desztillált víz keveréke) szuszpendáljuk, majd a szuszpenzióhoz 4,55 ml Sudan Black B festéket [10 mg/ml koncentrációjú vízmentes etanolos oldat formájában használjuk, gyártja a Fisher \ Scientific Company cég] adunk, miközben a szuszpenziót mágneses keverővei keverjük. Az így festett flokkulált antigént lezárt üvegedényben 4°C-on tároljuk. Az így készülf antigén-reagenskészítmény in vitro felhasználásra kész. 4. példa In vitro teszt Neisseria gonorrhoeae antitest detektálására A tesztet olyan emberi vérszérummal végezzük, amelyet 62—63 °C-on tartottunk 0,5 órán át. Kereskedelemben beszerezhető fehér teszt kártyán [szállítója a Fisher Diagnostics Division (Orange-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
