174883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén kinyerésére és az antigént tartalmazó reagenskészítmény előállítására
9 174883 10 zióban levő lecitinmennyiséget állítjuk be azután 0,9%-os koleszterin-oldatokban. Az előzőekben ismertetett módon extrahált antigént tartalmazó tartályba bemérjük az előzőekben ismertetett módon előállított, lecitint és koleszterint tartalmazó szuszpenziót. A tartály tartalmát ezután alaposan összekeverjük, majd legalább 5 percen át állni hagyjuk. Ezután a szilárd anyagot centrifugálás útján elválasztjuk, majd USR jelzésű szuszpendáló közegben újra szuszpendáljuk. Ezután a szuszpenziót megfestjük a felhasználni kívánt zsíroldható festékkel vagy festékkeverékkel. Az így kapott találmány szerinti antigén-reagenskészítménnyel ezután a találmány értelmében Neisseria gonorrhoeae okozta fertőzés kimutatására szolgáló agglutinációs tesztet úgy hajtjuk végre, hogy az antigén-reagenskészítményt a vizsgálandó szérummal összekeverjük, és az eredményt megfigyeljük. Ugyanez a meghatározás a találmány értelmében elvégezhető egy olyan teszt kártyával, amelyen egy kísérleti folt van, például egy körrel határolt terület, amely terület adaptálva van egy vizsgálandó minta és a találmány szerinti antigén-reagenskészítmény fogadására, amikoris a meghatározást úgy végezzük, hogy a kísérleti foltot először a vizsgálandó szérummal, majd a találmány szerinti antigén-reagenskészítménnyel érintkeztetjük. A találmány szerinti antigén-reagenskészítmény felhasználásával végezhető agglutinációs tesztek közül előnyösnek tartjuk a teszt kártyával végzett meghatározást. A teszt kártyának egyenletes felületűnek kell lennie a kísérleti eredmény könnyű megfigyelhetősége céljából. Bár a technika állása szerint korábban javasolták, hogy a felület nedvesíthető legyen, vizsgálataink szerint ez nem feltétlenül szükséges és csupán csak előnyös, ha a felület nedvesíthető. A kártya alaposan kalanderezett papírból vagy kartonból készülhet és abszorpcióképes lehet, előnyösen azonban csak kismértékű lehet az abszorpcióképessége. A találmány szerinti antigén-reagenskészítmény egyik jellegzetessége, hogy a kísérleti eredmény megfigyelhető függetlenül attól, hogy a folt nedves-e vagy száraz, és így tehát az eredmény hamarabb megállapítható, mint az egyéb ismert módszerek esetében. A kártya lehet továbbá papír- vagy kartonbázisú rétegelt termék, amelynek víz által átjárható vagy víz által át nem járható rétege, például polietilén-bevonata lehet. Maga a papír vagy pedig e bevonat olyan színű kell, hogy legyen, amilyen szín elütő a kísérletben alkalmazott festék színétől. Alapvetően bármely olyan kártya alkalmazható, amelynek szerkezete és összetétele hasonló a 3 074 853 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett kártyáéhoz. A kártya felhasználásával a tesztet úgy hajtjuk végre, hogy a vizsgálandó szérumból — amelyet mintegy 0,5 órán át mintegy 62—63 °C hőmérsékleten tartottunk — mintegy 0,05 ml-t és mintegy 1/60 ml antigén-reagenst felviszünk kereskedelmi forgalomban kapható, műanyagbevonatos kártyára nyomott kör - amelynek átmérője közel 18 mm — határán belülre. A kártyát ezután 4—20 percen át 80—180 fordulat/perc sebességgel forgatott forgatógépen forgatjuk, azonban kézzel végzett rázás is hatásos lehet. A kártyán ezután megvizsgáljuk, hogy a jellegzetes csomósodás bekövetkezett-e vagy sem. A találmány szerinti vizsgálókészlet Neisseria gonorrhoeae által okozott fertőzés kimutatására szolgáló agglutinációs teszt végrehajtására az alábbi fő összetevőkből áll: legalább egy olyan kísérleti kártya, amelyen több kísérleti folt, például az antigén-reagenskészítmény és a kontrollszérum fogadására adaptált kör alakú terület van, az előzőekben ismertetett módon előállítható antigén-reagenskészítményhez egy tartály, egy tartály az aktív szérumhoz, egy tartály a gyengén aktív kontroliszérumhoz, és egy tartály a nem aktív kontrollszérumhoz. A vizsgálókészlet tartalmazhat további összetevőket, így például mintavevő kémcsöveket, gumidugókat, stb. A találmányt közelebbről az alábbi kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani: 1. példa Neisseria gonorrhoeae antigén előállítása sejtekből és táptalajból Liofilizált, 0,5 ml-es aliquotból Neisseria gonorrhoeae B 370 törzs (deponálva ATCC 21824 szám alatt) törzstenyészetét készítjük el az alábbi módon: 0,5 ml steril desztillált vízzel végzett rehidratálás után a kapott folyadékból 0,1—0,1 ml-es aliquotokat csokoládé-eugon agarra [ezt úgy állítjuk elő, hogy a Becton, Dickinson and Company (Cockeysville, Maryland állam) Amerikai Egyesült Államok-beli cég által szállított eugon-agarhoz 10% steril defibrált nyúlvért adunk és a kapott keveréket 65 °C-on tartjuk 10 percen át] visszük át és inkubáljuk egy lezárható tartályban 36 °C-on 24 órán át. Az így kapott anyaggal 2 liternyi pepton-táptalajt (a pepton-táptalajt úgy készítjük, hogy 15 g kazein-hidrolizátumot, .5 g szójabab-hidrolizátumot, 0,5 g nátrium-kloridot, 0,3 g dinátrium-hidrogén-foszfátot és 2,5 g dextrózt összekeverünk, majd vízzel 1 literre kiegészítünk) oltunk be, majd 36°C-os helyiségben a táptalajt 100 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. A 30 literes térfogatú fermentor beoltására az így kapott tenyészetből 1300 ml-í használunk. A pepton-táptalaj összes komponensét a fermentorban sterilizáljuk, kivéve a glükózt, amelyet külön adagolunk. Közel 24 óra elteltével a tenyészetet elöljük és konzerváljuk olyan mennyiségű formaldehid adagolása útján, hogy a formaldehid koncentrációja 2 térfogat% legyen. Ezután a táptalajtól a sejteket centrifugálás útján elválasztjuk és a felülúszó fázist steril körülmények között tároljuk. A sejteket tízszeres térfogatú [súly/térfogat arányban] és 8,8 pH-jú olyan pufferoldatban tartjuk 1 éjszakán át extrahálás céljából, amely kálium-kloridra 1,0 mólos és dinátrium-hidrogén-foszfátra 0,1 mólos. Ezt követően a sejteket centrifugálás útján eltávolítjuk, majd az extraktumot közel századrésznyire betöményítjük ultraszűrés [az ultraszűrést az Ámicon Corporation (Lexington, Massachusetts állam) Amerikai Egyesült 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
