174883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén kinyerésére és az antigént tartalmazó reagenskészítmény előállítására
7 174883 8 puffer koncentrációja legalább 0,01 mól, ezt követően a szolubilizált antigént lebontásnak vetjük alá egy proteolitikus enzimmel mintegy 0,25 óra és mintegy 4 óra közötti időn át mintegy 0 °C és mintegy 45 °C közötti hőmérsékleten, és végül az antigén enzimes lebontását megszakítjuk. Különösen előnyösen úgy különíthetünk el antigént olyan táptalajokból, amelyekben Neisseria gonorrhoeae sejtek növekedtek, hogy először a sejteket elkülönítjük a táptalajtól, ezután a táptalajt koncentráljuk, majd az antigént a táptalajból kicsapjuk egy olyan vizes savoldattal vagy savas kémhatású pufferoldattal, amelynek a pH-ja mintegy 2,0 és mintegy 4,0 közötti és amelyben a sav vagy a puffer koncentrációja legalább 0,1 mól, ezt követően a savasan kicsapott anyagból az antigént extraháljuk olyan vizes, lúgosra pufferolt alkálifémsó-oldattal vagy lúgos kémhatású vizes pufferoldattal, amelynek pH-ja mintegy 8,2 és mintegy 8,8 közötti és amelyben a puffer koncentrációja mintegy 0,1 mól és a sóé mintegy 1,0 mól, ezután megismételjük a savas kicsapás lépését, majd a savval kicsapott antigént olyan lúgos pufferoldattal szolubilizáljuk, amelynek pH-ja mintegy 8,2 és mintegy 8,8 közötti és amelyben a puffer koncentrációja mintegy 0,05 mól és mintegy 0,1 mól közötti, ezt követően a szolubilizált antigént egy proteolitikus enzimmel lebontásnak vetjük alá mintegy 0,25 óra és mintegy 4 óra közötti időn át mintegy 0 °C és mintegy 45 °C közötti hőmérsékleten, és végül az antigén enzimatikus lebontását megszakítjuk. Az antigénnek a táptalajból való kinyerése során a táptalajt a sejtek kiszűrését követően például ultracentrifugálás, szárítás vagy dializálás útján koncentrálhatjuk. Ha szárítjuk a táptalajt, akkor a koncentrátumot újrahidratáljuk savas kémhatású vizes pufferoldattal, amelynek pH-ja mintegy 1,0 és mintegy 6,0, optimálisan mintegy 2,0 és mintegy 4,0 közötti, különösen előnyösen mintegy 3,6. Az így kapott antigén ezután felhasználható vagy pedig tovább tisztítható. Ha további tisztítást végzünk, akkor az újrahidratáláskor kapott folyadékból az oldhatatlan anyagot kiszűrjük, majd többször savas pufferoldattal mossuk az oldható anyag eltávolítása céljából. Ezután a visszamaradó szilárd anyagot savas pufferoldatban szuszpendáljuk, majd a szuszpendált anyagot például centrifugálás vagy szűrés útján elkülönítjük. Az elkülönített anyagot ezt követően legfeljebb mintegy 11,0 pH-jú, előnyösen 8,2 és 8,8 közötti pH-jú lúgos pufferoldatban oldjuk. Ezután a korábbiakban már ismertetett módon végrehajtjuk az enzimes lebontást. Ha nem szárítjuk, akkor az enzimes lebontáskor kapott anyagot alaposan dializáljuk 0,001 mólos és 3 mólos közötti, előnyösen 0,15 mólos nátrium-klorid-oldattal szemben. Az így kapott anyagot ezután antigénként felhasználhatjuk vagy pedig tovább tisztíthatjuk. Az utóbbi esetben pH-ját 4,8 és 5,5 közé állítjuk be egy savval, előnyösen sósavval. A képződő csapadékot eldobjuk, a felülúszó fázis pH-ját pedig 3,6-ra beállítjuk. A kiváló csapadékot elkülönítjük, majd mintegy 3,6-es pH-jú savas pufferoldattal mossuk. Ezután a csapadékot feloldjuk egy 6,0 és 11,0 pH közötti, előnyösen 8,2 és 8,8 pH közötti pH-értékű lúgos pufferoldatban, majd a korábbiakban ismertetett módon enzimes lebontást végzünk. Savas és lúgos pufferoldatokként a korábban felsoroltak valamelyikét használhatjuk. Miként említettük, az előzőekben ismertetett elkülönítési módszerek bármelyikével kapott bármelyik antigén felhasználható önmagában vagy egymással kombinálva a találmány szerinti antigén-reagenskészítmények előállításában. Az utóbbit a találmány értelmében Neisseria gonorrhoeae okozta fertőzés kimutatására úgy állítjuk elő, hogy az előzőekben ismertetett módon elkülönített valamelyik antigént vagy antigének keverékét koleszterin-lecitin részecskékkel adszorbeáltatjuk, majd az így kapott antigén-koleszterin-lecitin komplex részecskéket egy zsíroldható festék jelenlétében megszárítjuk. Az antigén-reagenskészítmény előállításában használt antigén mennyisége mintegy 0,01 és mintegy 4,0 optikai sűrűség-egység (280nm-nél mérve) közötti, a koleszterin mennyisége mintegy 0,7% és mintegy 1,4% közötti, a lecitin mennyisége mintegy 0,1% mintegy 2,0% közötti, míg a zsíroldható festék mennyisége mintegy 1 mg% és mintegy 100 mg% közötti lehet. Festékként használhatunk például Sudan Black B, Basic Brown, Amethyst Violet, Nile Blue A vagy Azocarmine G jelzésű festékanyagokat vagy ezek keverékeit. A festékek vagy keverékeik a találmány szerinti reagenskészítményben e célra ismert oldószerekkel, pufferekkel és egyéb segédanyagokkal kombinációban vannak jelen. A találmány szerinti antigén-reagenskészítmények két lényeges komponense közül az aníigén-lecitin-koleszterin komplex mennyisége az antigénre vonatkoztatva mintegy 0,1 mg% és mintegy 1 mg% között, míg a festék mennyisége mintegy 1 mg% és mintegy 100 mg% között változhat, a reagenskészítmény teljes súlyára (beleértve az oldószereket, így vizet, alkoholokat, stb, valamint a pufferanyagokat) vonatkoztatva. A koleszterin-lecitin részecskék előállítása során úgy járunk el, hogy kereskedelmi forgalomban kapható, hamumentes koleszterint feloldunk vízmentes etanolban olyan mennyiségben, hogy egy 1,2%-os oldatot kapjuk. Ezzel egyidejűleg kereskedelmi forgalomban kapható, tojás-, marhahús- vagy zöldség-lecitint, például szójabab-lecitint vízmentes etanolban szolubilizálunk. A két komponenst ezután vízmentes etanolban összekeverjük olyan arányban, hogy a koleszterin végső koncentrációja mintegy 0,7% és mintegy 1,1% közötti, előnyösen mintegy 0,9% és a lecitin végső koncentrációja mintegy 0,1% és mintegy 2,0% közötti, előnyösen mintegy 0,22% legyen. Az antigén-szuszpenzióhoz szükséges lecitin optimális mennyiségét úgy állapítjuk meg, hogy 0,9%-os koleszterin-oldathoz fokozatosan növekvő mennyiségű lecitint adunk. Az így kapott minden egyes lecitin-koleszterin eleggyel ezután az alábbiakban még ismertetett módon antigén-szuszpenziókat készítünk, majd vizsgáljuk ezen szuszpenziók közül az optimális aktivitásút, fertőzött és feltételezhetően nem fertőzött személyektől vett vérszérummal szemben. Az optimális aktivitású szuszpen5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
