174695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására
5 174695 6 Kísérleteink során megállapítottuk, hogy azok a tenyészetek, amelyeket a szelekció során sztreptomicin, dezoxisztreptamin, sztreptidin és kobaltklorid tartalmú táptalajokon állítottuk elő, kitűnnek nagy össz-gentamicin antibiotikum (különösen gentamicin C és gentamicin B-B,), valamint garamin szintetizáló képességükkel. Az eredmény egyik lehetséges magyarázatául megemlíthetjük, hogy a speciális táptalajok metabolit-antimetabolit tartalma révén olyan tenyészeteket állítottunk elő, amelyekben az aminoglikozid antibiotikumok bioszintezisében résztvevő enzimek érzéketlenek magukra az aminoglikozid antibiotikumokra, vagy intermedieijeikre. Ily módon a tenyészetekben az aminoglikozid antibiotikumok bioszintézisének sebessége nincs szabályozva (csökkentve) az antibiotikumok, illetve intermedierjeik által, s így akadálytalan a bioszintézis folyamata, ez többlet-termelést eredményez. Kísérleteinkben megállapítottuk továbbá, hogy egyszerű cukrok (mint pl. glükóz, fruktóz), továbbá aminosav elegyek gátolják a fermentáció sikere szempontjából fontos amiláz és proteáz enzimek bioszintézisét. Ezért a szelektív táptalajokban, továbbá az oltóanyagok előállításához használt táptalajokban nem alkalmazunk egyszerű cukrokat, aminosavakat, szervetlen nitrogén vegyületeket. Ily módon olyan tenyészeteket kapunk az említett metabolitokkal-antimetabolitokkal kiegészített szelektív táptalajokon, melyeknek az amiláz és proteáz aktivitása jelentősen nagyobb, mint a kiindulási tenyészeté. A gentamicint, a sziszomicint és a garamint réteg- és/vagy papírkromatográfiás módszerrel azonosítjuk: Leszálló papírkromatográfia: 1-es számú Whatman papírt használunk, futtatóként a kloroform : metanol : 17%-os ammóniumhidroxid = 2:1:1 arányú elegyének az alsó fázisát. A felső fázist a kromatografáló kádhoz helyezzük használat előtt 3 órával. A futtatást 25 °C-on, 8 órán át végezzük, majd a papír megszárítása után 1%-os ninhidrin oldattal (jj-propanolban) permetezzük. Végül a papírt 105 C-os termosztátba helyezzük 10 percig. A gentamicin antibiotikumok, a sziszomicin és a garamin piros-lila-bamáslila foltok alakjában láthatók. A vizsgálandó anyagokból vagy keverékekből — vizes oldat formájában — annyit viszünk föl papírra hogy egyenként legalább 50 meg koncentrációjúak legyenek. Rf-értékek: gentamicin Cla 0,18, gentamicin C2 :0,23, gentamicin Ci :0,59, sziszomicin: 0,21, garamin 0,30. (G.H. Wagman, M.J. Weinstein: Chromatography of Antibiotics. Elsevier Sci.Pub.Co., New York, 1973. R.Okachi és mtsai: J.Antibiotics 27, 793—800, 1974.) Rétegkromatográfia: Szilikagél HF lemezeket használunk, futtatószerként kloroform : metanol : 25%-os ammóniumhidroxid oldat = 2:1 :1 arányú elegy alsó fázisát használjuk. Két órás futtatás után a lemezeket előhívjuk, azonos módon, mint a papírkromatogrammokat. Rf-értékek: gentamicin Cu : 0,21, gentamicin C2 :0,28, gentamicin a :0,35, sziszomicin :0,22, garamin: 0,26. Kísérleteinkben az összes gentamicin antibiotikum aktivitását Bacillus subtilis ATCC 6633 törzzsel, agar diffúziós módszerrel határoztuk meg, és gentamicin C standardra vonatkoztattuk. A proteáz aktivitást Anson szerint (J.Gen.Physiol. 22, 79 /1939/), az amiláz aktivitást az SKB módszerrel (Cereal, Chem. 16, 712 /1939/) határoztuk meg. l^i-Anson egység alatt az 1 Anson egység milliomod, 1 m-SKB alatt az 1 SKB egység ezredrészét értjük. A példákban bemutatjuk az eljárás részleteit, de ezzel nem kívánjuk korlátozni a találmány körét. A találmány más Micromonospora törzsekre is vonatkozik, amelyek aminoglikozid antibiotikumokat termelnek, és amelyek a törzs-gyűjteményekben hozzáférhetők. A találmány természetesen jól alkalmazható olyan aminoglikozid antibiotikumokat termelő Micromonospora tenyészetek előállítására, melyeket előbb bármilyen mutagén behatásnak tettük ki, ebben az esetben a mutagén behatás után szelektív táptalajként az említett metabolitokkal, antimetabolitokkal, szubletális dózisban kiegészített táptalajt alkalmazunk. Mutagénként alkalmazhatunk az irodalomban ismert bármilyen mutagént, így ultraibolya, Röntgen, gamma sugárzást, kémiai mutagéneket, így nitrogénmustárokat, nitrózóguanidint, salétromsavat stb. 1. példa A Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122 törzs mélyhűtve (-15°C-on) tárolt vegetatív tenyészetéből olyan hígítást készítünk steril desztillált vízzel, hogy a szuszpenzió élő csíra tartalma (103-104)ml legyen. Ennek a szuszpenziónak 1-1 ml-ével beoltjuk a következő összetételű táptalajokat: A) Pepton 6,0 g élesztőkivonat 3,0 g, húskivonat 1,5 g, kazein hidrolizátum 4,0 g, káhum-dihidrogén-foszfát 1,0 g, magnézium-szulfát • 7H20 0,5 g, ammóniumszulfát 3,5 g, L-aszparagin 1,5 g, glükóz 10.0 g, nátriumklorid 0,1 g, kálciumklorid • 6H2 O 0,1 g, nyomelemoldat 1,0 ml, agar 20,0 g, desztillált viz 1000 ml, pH = 7,0. A nyomelemoldat összetétele: bórsav 50 mg, rézszulfát*5H20 4 mg, káliumjodid 10 mg, vas(IH)klorid • 6H20 10 mg, mangánszulfát * 4H20 40 mg, ammóniummolibdenát* 4H20 40 mg, desztillált víz 100 ml. B) Pepton 6,0 g, élesztőkivonat 3,0 g, húskivonat 1,5 g, kálium-dihidrogén-foszfát 1,0 g magnéziumszulfát • 7H20 _0,5g, oldható keményítő 10.0 g, nátriumklorid 1,0 g kálciumklorid. 6H20 0,1 g, nyomelemoldat 1,0 ml, agar 20,0 g, desztillált víz 1000 ml, pH = 7,0. Ehhez a B) táptalajhoz, 1000 ml térfogatra számolva adagolunk 1,4 g sztreptomicinszulfátot, 0,5 g dezoxisztreptaminszulfátot, 0,7 g sztreptidinszulfátot és 1,2 g kobaltklorid • 2H20-t. Az igy előkészített steril szilárd táptalajokat oltjuk be a törzs megfelelően hígított tenyészetével. Beoltás után a tenyészeteket 37 °C-on inkubáljuk 8 napig. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
