174695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására
3 174695 4 rációja miatt a gentamicin C kinyerése általában bonyolult módszerekkel és nagy veszteséggel történik (pl. 3 091 572 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Nagy tisztaságú gentamicin C nyerhető a 170 416 és 168 778 számú magyar szabadalmi leírások szerint, de számos olyan lépés közbeiktatása ugyancsak szükséges a viszonylag alacsony gentamicin koncentráció miatt, mely üzemileg nehézkessé teszi az eljárás kivitelezését. Ismeretes továbbá, hogy a Micromonospora fajoknak a fermentációs (termelő) táptalajai általában szerves nitrogén forrásként szójalisztet, élesztőkivonatot, húskivonatot, mogyorólisztet, kazeint, kazein-hidrolizátumot stb., továbbá szén-forrásként keményítőt, dextrint, szacharózt, dextrózt, glicerint, valamint szervetlen nitrogén-vegyületeket és - különösen előnyösen - kobalt sókat tartalmaznak. Mindezek a táptalajok, amelyek ezeket a nagy molekulasúlyú polimer vegyületeket (különösen fehérjéket, poliszacharidokat, keményítőt, nukleinsavakat) tartalmazzák, e sugárgombák fermentációja folyamán - már a korai szakaszban is — erősen viszkózussá válnak (nem newtoni jellegű szuszpenziók), aminek a következménye a csökkent oxigén beoldódási sebesség (S. Aiba, A.E. Humphray, N.F. Millis: Biochemical Engenieering, Academic Press, New York, 1973). Ez részben előnytelenül befolyásolja az antibiotikum termelést, részben a fermentációs időt is növeli. A találmány tárgya gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására Micromonospora törzsekkel oly módon, hogy a törzs tenyészetének előállításához aminoglikozid, antibiotikumokat, dezoxisztreptamint, sztreptidint, garamint, purpurozamint, valamint kobalt-, mangán-, réz-ionokat tartalmazó táptalajokat alkalmazunk és az ily módon nyert nagyobb termelőképességű és nagyobb amiláz-proteáz aktivitású tenyészeteket aerob körülmények között, fehérjét, szénhidrátot és ásványi sókat tartalmazó táptalajban, 22-45 °C-on tenyésztjük, majd a keletkezett antibiotikumokat és a garamint a fermentléből elkülönítjük és kívánt komponenseire szétválasztjuk. A találmány tehát Micromonospora törzsek, így a Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122, a Micromonospora echinospore NRRL-2985, a Micromonospora grisea NRRL-3800 törzsek és utódaik tenyészeteinek előállítására vonatkozik, a tenyészetek előállításához olyan szelektív táptalajokat alkalmazunk, melyek aminoglikozid antibiotikumként sztreptomicint, neomicint, kanamicin A-t, kanamicin B-t, gentamicin C-t, gentamicin B-t, gentamicin B, -t, gentamicin A-t, gentamicin X-t, sziszomicint tartalmaznak szubletális koncentrációban, ezeket a metabolitokat, illetve antimetabolitokat célszerűen együttesen alkalmazzuk, például a Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122 törzs esetében sztreptomicint, dezoxisztreptamint, sztreptidint és kobalt-ionokat használunk együttesen, előnyösen 1400, 700, 500 és 250 gamma/ml koncentrációban. A találmány továbbá a tenyészetek fermentációs úton való alkalmazására is vonatkozik, és ehhez olyan tenyészeteket alkalmazunk, melyeknek proteáz aktivitása legalább 250/a-Anson E/ml, és amiláz aktivitása legalább 320 m-SKB/ml a fermentációjuk folyamán, ezért a tenyészetekhez előnyösen alkalmazhatunk viszonylag nagy szárazanyagtartalmú táptalajokat, így 3-6% szójalisztet, 3-6% kukoricalisztet és/vagy kukorícakeményítőt, 0,1-0,8% kalciumkarbonátot 10-100 gamma/ml kobaltkloridot, 0,2-2,5% pálmaolajat és/vagy szójaolajat tartalmazó fermentációs táptalajokat, s a fermentálást csőfermentorban végezhetjük. A találmány a gentamicin antibiotikumok, a sziszomicin és a garamin vizes oldatokból, fermentléből történő izolálási módszerének az egyszerűsítését és továbbfejlesztését is eredményezi, ezért a gentamicin antibiotikumokat és a garamint ammonium formában levő karboxil típusú fmomszemcsés kationcserélő gyantán megkötjük, majd a gentamicin C kivételével az egyéb gentamicin típusú vegyületeket, így többek között a gentamicin B-t, és gentamicin Bx -t, a sziszomicint, továbbá a garamint ammóniumhidroxid 0,08—0,1 On koncentrációjú vizes oldatának segítségével leoldjuk, végül 0,25—0,35 n, előnyösen 0,3 n koncentrációjú ammóniumhidroxid vizes oldatával a gentamicin C-t eluáljuk, s a gentamicin C-t tartalmazó elkülönített frakciókból az ammonium bázist és a vizet eltávolítjuk és kívánság szerint ásványi sav, előnyösen kénsav sójaként oldószerrel kicsapjuk. Hasonló módon, a megfelelő frakciókból a gentamicin B és Bj, a sziszomicin, továbbá a garamin ásványi sója, előnyösen kénsav sója előállítható. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy ha önmagukban ismert mutagén behatások után, vagy mutagén kezelés nélküli szelekció esetén a tenyészeteket speciális táptalajokon inkubáljuk, az egyedek, illetve a populáció összes gentamicin antibiotikus termelése jelentősen megnő. A Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122 törzs esetében az ily módon előkészített tenyészetek 1200—1600 gamma/ml össz-gentamicint termelnek. Speciális táptalajok alatt olyan szilárd (agaros) táptalajokat értünk, amelyek bizonyos metabolit-analógokat, antimetabolitokat, illetve bizonyos szervetlen ionokat tartalmaznak, ily módon ezeket nagy koncentrációban tűrő tenyészeteket állítunk elő. Metabolit-analógokként, illetve antimetabolitokként a következő vegyületeket alkalmazzuk: A saját antibiotikummal szembeni rezisztencia kialakítása mellett elsősorban az analóg-szerkezetű metabolitokat alkalmazzuk szelektív ágensként, továbbá a „saját” antibiotikum egyes molekula-részletét. így a Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122 és a Micromonospora echinospora NRRL-2985, valamint a Micromonospora grisea NRRL-3800 törzsek esetében kanamicint, sztreptomicint, neomicint (ezek olyan aminoglikozid antibiotikumok, melyeket a törzsek nem szintetizálják), továbbá sziszomicint, gentamicin B-BrL gentamicin A-t, gentamicin X-t, dezoxisztreptamint, purpurozamint, garózamint, sztreptidint használunk a táptalajokban, a törzsek szelekciójánál, lágyan' csak alkalmazunk kobalt, mangán és réz vegyületeket, e szervetlen ionokkal szembeni fokozottabb érzéketlenség kifejlesztése érdekében. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
