174649. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kalcitonin-származék előállítására
11 174649 12 Aminosav-elemzés A vizsgálandó minta 20 mennyiségét 0,25 ml 6- n sósavban 105°-on 24 óra hosszat hidrolizáljuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 1,2 ml 3,25 pH-ju 0,2 n citrát pufferoldatban feloldjuk, és ennek az oldatnak 1 ml-ét használjuk fel az aminosav elemzéshez. 1.) példa H-Cys-ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-V al-Leu-Gly-Ly s- -Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-P^o-Arg• -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NHj • CH3COOH 720 mg BOC-Lys (DIP) -Leu-Ser (Bzl) -Gln-Glu (OBzl)-Leu-His-Lys (DIP) -Leu-Gln-Thr (Bzl) -Tyr (Bzl -Pro-Arg(Tos) -Thr(Bzl) -Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2-t-5°-on 5 ml trifluorecetsavban feloldunk, és szobahőmérsékleten 15 percig keverjük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk, és a kapott maradékhoz dietilétert adunk, mire csapadék válik ki. A csapadékot nétriumhidroxidon szárítjuk, majd 1 ml dimetilformamidban feloldjuk. Ehhez az oldathoz -5°-on 30 ml 1-hidroxibenzotriazolt, 45 mg diciklohexilkarbodiimidet és 220 mg BOC-Cys-Ser- Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-OH-t adunk, és 2 óra hosszat 0°-on, majd éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakciókeverékhez vizet adunk, a keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk, vízzel és etilacetáttal alaposan mossuk és vákuumban meg szárítjuk. 740 mg nyers terméket kapunk. 640 mg nyers terméket 3 g fenol és 2,5 ml anizol jelenlétében egy óra hosszat 20°-on hidrogénfluoriddal reagáltatunk. Miután a hidrogénfluoridot ledesztilláltuk, a maradékot 200 ml 0,5 mólos ecetsavban feloldjuk. Az oldatot 150 ml etilacetáttal mossuk, majd acetát-fázisú Dovex 1x2 gyantával töltött 2 cm átmérőjű és 20 cm hosszú oszlopon vezetjük át, és az eluátumot liofilizálva 590 mg poralakú terméket kapunk. 500 mg kapott port 50 ml vízben feloldunk, az oldat pH-ját sósavval 4,37-re állítjuk be, és 2,0 cm átmérőjű 63 cm hosszú, karboximetilcellulózzal töltött oszlopra visszük fel 4,37 pH-jú 0,01 mólos ammóniumacetát-oldattal, majd 4 liter 4,37 pH-jú 0,01 mólos acetátpufferral és 8 liter 4,37 pH-jú 0,01 mólos ammóniumformiáttal mossuk. Ezután az oszlopot 12 liter ammóniumformiáttal eluáljuk, és közben az eluáló oldat koncentrációját fokozatosan 0,01 mólról (pH = 4,37) 0,07 mólra (pH = 6,0) változtatjuk. Az eluátumot 100 ml-es frakciókban fogjuk fel, és a biológiai meghatározással aktívnak talált frakciókat összegyűjtve, ezeket a frakciókat az aktív por kinyerésére liofilizáljuk. 50 mg aktív port 5 ml 0,1 n hangyasavban feloldunk, az oldatot 1,2 cm átmérőjű 250 cm hosszú, Sephadex G-50 oszlopon vezetjük át, és óránkint 10 ml áramlási sebességgel 0,1 n hangyasavval eluáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtve és liofilizálva a cím szerinti vegyületet kapjuk. Olvadáspontja 220° (bomlik). [a] £)° = - 75° (c = 1,0,1 n hangyasav). Hatékonysága = 4000 MRC u/mg Aminosavelemzés : Leu 5.10(5), Thr 3.48(4), Val 2.20(2), Gly 3.00(3), Lys 1.98(2), Glu 3.27(3), His 0.95(1), Tyr 0.90(1), Pro 1.96(2), Arg 1.03(1), Asp 2.07(2), Ala 0.94(1). R, értéke: 0,65-0,71 (cellulóz hordozóanyagon, 15:10:3:12 arányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz eleggyel kifejlesztve). A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő:' 11.—32. aminosavakból álló peptid-fragmens BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(DIP)Leu-GÍn-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr (Bzl>Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 1) BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2 220 ml tetrahidrofuránhoz hozzáadunk 67,7 g BOC-Thr(Bzl>OH-t 33,0 g H-Pro- NH2-HCl-t és 29,6 g 1-hidroxibenzotriazolt, majd—5°-on hűtés közben 40,0 ml N-etil-N’- dimetilaminopropil-karbodiimidet adunk hozzá, és 1 óra hosszat—5°-on, majd éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakciókeveréket bepároljuk, a maradékhoz 800 ml etilacetátot adunk, és kétszer 400 ml n sósavval és kétszer 300 ml 5 %-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. A szerves réteget vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott olajos maradékot 450 g kovasavgéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 1:1 arányú benzol-etilacetát eleggyel, majd ugyanilyen arányú etilacetát és metanol eleggyel végezzük, és az eluált frakciókat kovasavgélen vékonyrétegkromatografálással vizsgáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, 500 ml etilacetátban feloldjuk, majd kétszer 300 ml 5 %-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. Vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, vákuumban bepároljuk, és a maradékot n-hexánnal eldörzsölve fehér por alakjában 54,5 g (61,4 %) BOC-Thr(Bzl>Pro-NH2-t kapunk. Rf* = 0,48. [a] ^ = —14,0 0 (c=l, dimetilforformamid). 2) BOC—Ala-Gly-OBzl 450 ml tetrahidrofuránban feloldunk 94,6 g BOCAla-OH-t, 168,8 g H-Gly-OBzl- TosÜh-t és 67,6 g 1-hidroxibenzotriazolt, hozzáadunk 91,5 ml N-etil-N’-dimetilaminopropü- karbodiimidet, majd a reakciókeveréket 0°-on 1 óra hosszat, és szobahőmérsékleten éjjelen át keverjük. Ezután a reakciókeveréket vákuumban bepároljuk, és a maradékot 800 ml etilacetátban feloldjuk. Hozzáadunk 500 ml n sósavat, a keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk, az etilacetátos réteget egymásután 400 ml n sósavval, kétszer 5 %-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. Vízmentes magnéziumszulfáton történő szárítás után vákuumban bepároljuk. A maradékot n-hexánnal eldörzsölve 152,5 g nyers terméket kapunk. Etilacetát és n-hexán elegyéből kétszer átkristályosítva 144 g(85,7%) Boc-Ala-Gly-OBzl-t kapunk. Olvadáspontja 87-88,5°. Vékony rétegkromatografálással egyetlen foltot kapunk. Rlf =0,59. 3) BOC-Ala-Gly-OH 500 ml tetrahidrofuránban feloldunk 101 g BOCAla- Gly-OBzl-t, és 7 g 5 % palládiumtartalmú szén jelenlétében hidrogénezzük. 6 óra elteltével a katalizátort eltávolítjuk, az oldatot bepároljuk, a maradékot 800 ml tetrahidrofuránban feloldjuk, és 6,5 g, 5 % palládium tartalmú szén jelenlétében újra hidrogénezzük. 4 óra elteltével a katalizátort eltávolítjuk, az oldatot vákuumban bepároljuk, és a maradékot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
