174649. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kalcitonin-származék előállítására

9

174649

10

hajtottuk végre. Patkányok veséjéből és májából 5-szörös térfogatú 0,1 mólos trisz-HCl pufferrel 7,4 pH-n kivonatokat készítettünk, és a tisztított kivonat felüluszójából 5-szörös térfogatú hideg (4°C-os) acetonnal a fehérjét leválasztottuk. Az acetonos csapadékot levegőn szárítottuk, majd 0,1 mólos trisz-HCl puffer-oldatban feloldottuk (2,4 mg fehéije/ml), és a 20 MRC miliegység/m 1 koncentrációjú oldatot 1 óra hosszat 37°C-on inkubáltuk. Egyes adagokat a biológiai vizsgálatig fagyasztva tároltunk. Az értékeket a szérum kalcitoninszintjének mérésével friss szérum kalciumszintjéhez viszonyítva határoztuk meg.

Megállapítottuk, hogy a sertés kalcitonin hatékonysága nagyon gyorsan csökkent, ha patkány szérumban inkubáltuk. Az I képletű polipeptid és a lazac kalcitonin sokkal stabilabb volt, mint a sertés kalcitonin. Az (I) képletű vegyület az inkubálás után 6 és 11 órával hatékonyabb volt, mint a lazac kalcitonin.

Ha a vegyületeket emberi szérumban inkubáltuk, a sertés és lazac kalcitonin hipokalcémiás hatékonysága gyorsan csökkent; az eredeti hatékonyság 1 órás inkubációs idő alatt körülbelül 50 %-kal. Az I képletű vegyület hipokalcémiás hatékonysága csak 48 órás inkubációs idő után csökkent 50 %-kal.

A vegyületeket patkány vese- vagy májkivonatában 1 óra hosszat 37°C-on inkubálva a sertés kalcitonin 100 %-osan inaktiválódott, míg az I képletű vegyület és a lazac kalcitonin aktivitása lényegesen stabilabbnak bizonyult.

Az I képletű vegyület hatékonysága 3700-6000 MRC egység/mg, és tizenötször hatásosabb, mint az emberi és birka kalcitonin, húszszor hatásosabb a sertés és a szavasmarha kalcitoninnál, és legalább azonos vagy nagyobb hatású, mint a lazac kalcitonin.

Az I képletű vegyület hiperkalcémia, a pajzsmirigy hiányos vagy a mellékpajzsmirigy fokozott működése esetén a szérum kalciumszintje csökkentésére használható.

Kalciumot igénylő csontbetegségnél, például csontritkulásnál, csontlágyulásnál, csonttörésnél, a csontok fejlődési rendellenességénél, kortikoszteroidokat igénylő gyógykezelés okozta angolkórnál - különösen kalcium- és foszforterápiával együtt - a vegyület hatásosan alkalmazható, továbbá Paget-kór gyógyításánál, gyomorfekély megelőzésénél és gyógyításánál is jótékony hatású lehet. Előnye az is, hogy a szérumban, májban és vesében az ismert kalcinoninoknál stabilabb.

A leírásban használt rövidítések jelentése a következő;

BOC : terc-butoxikarbonilcsoport,

AOC ; terc-amiloxikarbonilcsoport,

DIP ; diizopropilmetoxikarbonilcsopori,

Cbz : benziloxikarbonilcsoport,

CICbz ; o-klórbenziloxikarbonilcsoport,

Bzl : benzilcsoport,

Mbzl : p-metoxibenzilcsoport,

Tos ; tozilcsoport,

OEt : etoxicsoport,

OBzl ; benziloxicsoport,

ONP : p-nitrofenoxicsoport,

OSU : N-hidroxiszukciniliminoxicsoport,

Cys : L-cistein,

Ser : L-szerin,

Asn ; L-aszparagin,

Leu ; L-leucin,

Thr : L-treonin,

Val : L-valin,

Pro : L-prolin,

Arg ; L-arginin,

Asp : L-aszparaginsav,

Alá ; L-alanin,

Gly : glicin,

Lys : L-lizin,

Gin ; L-glutamin,

• Glu : L-glutaminsav,

His : L-hisztidin,

Tyr : L-tirozin,

TFA ; trifluorecetsav,

TosOH : p-toluolszulfonsav,

CHA ; ciklohexilamin,

DCHA : diciklohexilamin,

THF : tetrahidrofurán,

DMF ; dimetilformamid,

AcOEt : etilacetát,

DCC ; diciklohexilkarbodiimid,

WSC : N-etil-N’-dimetilaminopropil-karbodiimid,

HOBT : 1-hidroxibenzotriazol,

MeOH : metanol,

EtOH : etanol,

AcOH ; ecetsav

A következő példák közelebbről szemléltetik a találmány szerinti eljárást anélkül, hogy azt ezekre korlátoznánk. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg.

A szérum kalciumszintjét csökkentő hatás meghatározásának módszerét, a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokban használt hordozóanyagokat és kifej - leszt őszereket, valamint az amino savelemzési módszert a következőkben adjuk meg.

Meghatározási módszer:

A vizsgálandó vegyület mintáját 0,1 n nátriumacetáttal készült 0,1 %-os albumin-oldattal megfelelően hígítjuk. A kétszeres hígításokból minden esetben 0,2 ml-t intramuszkulárisan hím patkányokba fecskendezünk. Az injekció után egy órával az összes patkányt megöljük, és vérüket felfogjuk. Minden egyes vérmintában abszorpciós spektrofotometria segítségével meghatározzuk a szérum kalciumszintjét. Másrészt sertés pajzsmirigyéből előállított kivonatot („Research Standard B”) 2,5, 5, 10, illetve 20 MRC m/0,2 ml értékre hígítjuk. Mindegyik hígításból 0,2 ml-t intramuszkulárisan hím patkányokba fecskendezzük, és a fenti módon az injekció után egy órával meghatározzuk a patkányok szérumában a kalciumszintet. A megfelelő alapoldat (Research Standard) hatékonyságához viszonyítva meghatározzuk a mintában a kalcitonin hatékonyságot.

Vékonyrétegkromatografálás.

Hordozó; kovasavgél, cellulóz.

Kifejlesztőszer:

1. kloroform-metilalkohol-ecetsav 95:5:3,

2. kloroform-metilalkohol-ecetsav 85:10:5,

3. kloroform-metilalkohol-ecetsav 80:25:2,

4. kloroform-metilalkohol-etilacetát 5:2:5,

5. kloroform-metilalkohol-ecetsav-víz 10:10:1:1,

6. benzol-etilacetát 2:1,

7. n-butanol-piridin-ecetsav-víz 15:10:3:12,

8. metilalkohol,

9. kloroform-metilalkohol-ecetsav 80:15:5.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5