174649. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kalcitonin-származék előállítására
7 174649 8 létercsoporttal védhetjük, de védelme nem szükségszerű. A 17.-32. aminosav-szekvenciát különböző módszeretekéi állíthatjuk elő. Ezt a peptid-fragmenst előnyösen a 24.-32. aminosav-szekvenciából álló nonapeptidamidnak a 17.-23. aminosav-szekvenciából álló heptapeptiddel való kondenzációjával vagy az említett nonapeptidnek a 20.—23. vagy 21.-23. aminosav-szekvenciával való kondenzációjával, majd ezután a többi aminosav-szekvenciával való kondenzációjával állíthatjuk elő. Az említett heptapeptidet előnyösen úgy állíthatjuk elő, hogy a 17.-19. tripeptidet vagy a 17.-20. tetrapeptidet az azidos módszerrel a 23. aminosavig terjedő fragmenssel kondenzáljuk. Ezekben az aminosavakban az a-aminocsoportot benziloxi-karbonil-csoporttal és az e-aminocsoportot terc-butoxi-karbonil-csoporttal védjük. A treoninban és tirozinban a hidroxilcsoportot nem okvetlenül szükséges védeni, de előnyösen terc-butilétercsoporttal védhetjük. A tirozinban a hidroxilcsoportot az a-aminocsoporttal egyidejűleg benziloxikarbonil-csoporttal védjük, és ezt a védőcsoportot hidrogénezéssel távolitjuk el. Az említett 24.-32. aminosavakból álló nonapeptidet úgy szintetizáljuk, hogy a 30.-32. tripeptidamint vagy a 29.-32. tetrapeptidamint, a 28.-32.pentapeptidamint vagy a 26.-32. heptapeptidamint a megelőző aminosav-szekvenciából álló peptid-fragmenssel kondenzáljuk. Ezt a kondenzációt előnyösen a Wünsch - módszerrel hajtjuk végre. A y-karboxilcsoportot előnyösen terc-butilészter-csoporttal védjük. A 10.-32. aminosavakból álló védetttrikozapeptidamidot a 17.-32. aminosavakból álló sornak a 10.-16 aminosavakból álló heptapeptidhidraziddal, azidos módszerrel végrehajtott kondenzációjával kapjuk. A 10.-32. aminosavakból álló védett trikozapeptidamid szintézisének másik előnyös módszere abból áll, hogy a 24.-32. aminosavakból álló C-terminális peptid-fragmenst kondenzáljuk a 10.-23. aminosavakból álló peptid-fragmenssel. A 10.-23. aminosavakból álló peptid-fragmenst többféle módszerrel állíthatjuk elő. Előnyös módszer az, ha a 10.-13. aminosavakból álló peptid-fragmenst a 14.-23. aminosavakból álló dekapeptiddel kondenzáljuk, vagy ha ezt a 10.-13. aminosavakból álló peptid-fragmenst a 14.-16., 14.-19. vagy 14.-20. aminosavakból álló peptid-fragmenssel, majd ezután a többi, a 23. aminosavat is magában foglaló fragmenssel kondenzáljuk. A fentiekben említett, védett a-aminocsoportot tartalmazó peptid-fragmens, például a 10.-32. aminosavakból álló trikozapeptidamid vagy a 11.-32. aminosavakból álló dekozapeptidamid C-terminálisának védőcsoportját alkalmas módszerrel úgy távolitjuk el, hogy például vizes ecetsavval a tritilcsoportot lehasítjuk. A difenil-izopropoxikarbonil-, benziloxikarbonil- és terc-butoxi-karbonil-csoportot jégecet, hangyasav és víz elegyével, hidrogénezéssel, illetve trifluorecetsawal távolitjuk el. Az azidos módszer vagy a Wünsch-módszer olyan N-terminális aminosav-szekvenciák kondenzációjához előnyös, amelyekben diszulfid-híd és legalább egy védett a-aminocsoport van (ilyen például az 1.-9. aminosavakból álló nonapeptid vagy az 1 .-10. aminosavakból álló dekapeptid), és amelyeket C-terminálist és ezenfelül szabad a-aminocsoportot tartalmazó peptid-fragmenssel kondenzálunk. Ilyen módon védett a-aminocsoportot, védett —aminocsoportot, kívánság esetén védett oldallánc-karbonilcsoportot és/vagy hidroxilcsoportot tartalmazó dotriakonta-peptidamidot kapunk. Ezeket a csoportokat a fent leírt módon távolitjuk el, és így végül az I képletű vegyületet kapjuk. Szabad merkaptocsoportot tartalmazó dotriakonta-peptidamidot ugyanolyan módszerrel állíthatunk elő, mint a védett dotriakonta-peptidamidot. Az említett merkaptocsoport védőcsoportját a szintézis utolsó lépésében kell eltávolítani, és a diszulfid-híd kialakítását az előzőekben leírt módszerrel hajtjuk végre, így I képletű vegyületet kapunk. A találmány szerinti I képletű új polipeptidet szabad bázis vagy só alakjában kaphatjuk. A szabad bázist sójából a szokásos módon szabadíthatjuk fel. A szabad bázist farmakológiailag elfogadható sóvá úgy alakíthatjuk, hogy a bázist szervetlen savval, például sósavval, hidrogénbromiddal, kénsavval vagy foszforsavval vagy szerves savval, például hangyasavval, ecetsavval, borostyánkősavval, almasavval, citromsavval borkősavval, benzoesawal, benzolszulfonsawal vagy toluolszulfonsawal reagáltatjuk. Az I képletű új polipeptid szerves vagy szervetlen anyag addicionálásával komplexé alakítható. Az említett komplexet úgy állítjuk elő, hogy hosszú szénláncú polipeptidhez bizonyos szervetlen vagy szerves anyagot adunk hozzá. Ennek jelentősége az, hogy a még nem tisztázott szerkezetű vegyület gyógyszerként a beadás után hosszú ideig hat. Az említett komplexképző anyagok példái közé tartoznak a fémek, például kalcium, magnézium vagy cink szervetlen vegyületei, különösen az említett fémek foszfátjai, pirofoszfátjai vagy polifoszfátjai. A komplex-képző szerves anyagok közé tartozik például a nem-antigén jellegű zselatin, a karboximetilcellulóz, a poliglutaminsav stb. Az I képletű új polipeptid biológiai hatását (hatékonysága 4000 MRC egység/mg) természetes sertés kalcitoninnal (hatékonysága 60 MRC egység/mg) és szintetikus lazac kalcitoninnal (hatékonysága 1500 MRC egység/mg) összehasonlítva vizsgáltuk. A vegyületek hipokalcémiás hatását Kumer és munkatársai módszere szerint [J. Endrocinology 33, 469^175 (1965)] határoztuk meg. Négy-öt hetes patkányok (Sprague-Dawley törzs) farokvénájába intravénásán 20 MRS miliegység, illetve 80 MRC miliegység vizsgálandó vegyület-oldatot fecskendeztünk. Adagonként 4-4 patkányból álló csoportokat kezeltünk. A befecskendezés után 60 perccel, majd 2, 3, 4, 5 és 8 óra múlva az állatokból vérmintát vettünk, és ebben meghatároztuk a szérum kalciumkoncentrációját. A különböző vegyületek hipokalcémiás hatásának időbeli lefolyását összehasonlítottuk 0,1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó 0,1 %-os nátriumacetát-oldat (7,4 pH értékű) szubkután beadása után 1, 2, 3, 4, 5 és 8 órával mért szérum kalciumszinttel. Az eredmények azt mutatják, hogy az I képletű vegyület hipokalcémiás hatásának időtartama nagyjából megegyezik a lazac kalcitoninéval, de lényegesen felülmúlja a sertés kalcitoninét. Az 1 képletű polipeptid hatékonyságának stabilitására in vitro inkubációs vizsgálatokat végeztünk. Az inkubációs vizsgálatokat 37°C-on patkány vagy humán szérumban 200 MRC miliegység anyaggal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
