174373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-nitro-9-[omega-(szubsztituált-amino)-alkil-amino]-akridinek és sóik előállítására
3 174373 4 citráttá, szukcináttá alakítjuk, illetve a kiváló 1-nitro-9-[to-(szubsztituá]t-amino)-alkil-amino]-akridin-monohidroklorid-csapadékot sósav éteres oldatával megsavanyítjuk, majd szerves oldószerből a dihídroklorídot átkristályosítjuk, vagy b) az l-nitro-9-feno\i-akridint vagy sóját fenollal elegyítjük, majd az elegy be egy cj-szubsztituált-amino-alkil-amint vagy sóját adjuk, majd az elegyet felmelegítjük 50— 120°C-ra, ezt követőleg a reakcióelegyet nagy mennyiségű szerves, vízzel nem elegyedő oldószerbe öntjük. A kapott elegyet alkáli-hidroxi-oldattal meglúgosítjuk, szerves, vízzel nem elegyedő oldószenei extraháljuk, szárítjuk és bepárlás után kristályosítjuk, majd kívánt esetben ásványi sav sóivá, például hidrokloriddá, hidrobromiddá, szulfáttá vagy szerves savak sóivá, például laktáttá, citráttá vagy szukcináttá alakítjuk a bázist, vagy hidrokloridsó kiindulási anyag esetén, a kiváló 1-nitro-9-[oj-(helyettesitett-amino)-alkil-amino]-akri din-monohi drokl őri d-csapadékot sósav éteres oldatával kezeljük és szerves oldószerből a dihidrokloridot átkristályosítjuk. Az l-nitro-9-aminoakridin új származékainak, azaz az 1 -nitro-9-[cc-(szubsztituált-amino)-alkil-aminoj-akridinnek daganatellenes tulajdonságait az alábbiakban leírt kísérletek során több ízben megvizsgáltuk és valamennyi esetben nagyfokú daganatellenes hatást tapasztaltunk. I. In vitro módszerek 1. Szövettenyészet (KB vonalak) Eagle és Foley [Cancer Research 18, 1017 (1958)] által kidolgozott és Smith és társai által módosított szövettenyészeten végzett vizsgálatokat [Cancer Research 19, 843—847 (1959)] alkalmaztuk. A kísérletet emberi eredetű daganatos sejteken úgynevezett KB vonalakon végeztük és az Eagle-féle táptalajt használtuk 10% borjúszérummal együtt. Kémcsöveket beoltottunk 4 ml 40—80 ezer sejtet tartalmazó szuszpenzióval, ami 40—80 pg sejtfehérjének felel meg. A tenyészet növekedését a sejtfehérje szaporulatából Folin-Cicaltean-féle reagenst és Oyama és Eagle [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91, 305 (1956)] által kidolgozott módszert alkalmazva fotometriásan határoztuk meg. Miközben a sejtekkel beoltottuk a kémcsöveket, a vizsgált vegyület 0,2 ml vizes oldatát adtuk hozzá oly módon, hogy a következő koncentrációkat kaptuk: 100, 10, 1, 0, 1, 0,1 és 0,001 pg/ml táptalaj. A kémcsövek inkubálása 37 °C-on történt. 72 óra múlva meghatároztuk a sejtfehérje szaporodását azokban a kémcsövekben, melyekben a készítményt elhelyeztük, valamint a kontroliban. Minden koncentrációt két kísérletben határoztunk meg, egymással párhuzamosan. Meghatároztuk az anyagnak azt a koncentrációját is, amelynek révén a sejtprotein növekedésének 50%-os gátlását sikerült elérni. Ez az úgynevezett ID50 a kontroliban mért végső protein-koncentráció Gátlás % = 100 -—------------------------------a kontroliban mért végső protein-koncentráció végső protein-koncentráció a kísérletben a kontroliban mért kezdeti protein-koncentráció Az általában elfogadott normák [Leiter J. Abbot B. J., Scharpatz S. A., Cancer Research 25, (3/2), 522 (1965)] szerint azok a vegyületek tekinthetők hatásosaknak, melyeknél az ID50 kisebb vagy egyenlő 1 pg/ml értékkel. Leiter és társai [Cancer Research 25, (3/2), 522 (1965)] szerint az ilyen vegyületeket, attól függetlenül, hogy az in vivő kísérletek szerint milyen eredményeket kapunk, klinikai vizsgálatnak kell alávetni. A fenti csoporthoz tartozó vegyületeket a fenti módszerrel többször is megvizsgáltuk. Az ID50 0,01—0,001 pg/ml között változik. 2. Miyamure-féle módszer (Ehrlích-féle ráksejtek) A módszer azon alapszik, hogy Ehrlich-féle ráksejtek (5 • 106/ml) dehidrogenáz aktivitásának gátlását a vizsgált vegyületek segítségével meghatározzuk, a meghatározás mértéke a nem-redukált redox-indikátor zónájának (redox-pigment) (reszazurin) átmérője, amelyet 5 órával a 37 °C-on történő inkubáció után kapunk a vizsgált vegyület 1%-os oldatát tartalmazó henger körül. Az általában elfogadott kritériumok szerint az anyag akkor tartható hatásosnak, ha a gátlási zóna legalább 20 mm. A találmány szerint előállított akridin-származékok különösen erős daganatellenes hatást mutatnak ebben a kísérletben, egyes vegyületeknél a zóna 26—42 mm. 3. Zsályamagok csírázásgátlása (növekedés teszt) 80 mm átmérőjű Petri-csészébe lehetőség szerint egyenletesen helyezünk el 20-25 zsályamagot két réteg szűrőpapírra. Ezt követően 1 mg/ml koncentrációban a Petri-csészékbe öntünk 30 ml, a vizsgálandó vegyületet tartalmazó oldatot, a kontroll csészékbe pedig desztillált vizet öntünk. Az edényeket 24 óráig inkubáljuk 20—30 °C-on,,^ majd lemérjük a keletkezett csírák hosszát. A gátló hatást a csírák átlag hosszának a kontrolihoz viszonyított százalékos csökkenéséből határozzuk meg. A zsályamagok csírázásánál a gátlás százalékos értéke 86-88% a találmány szerint előállított vegyületek esetében. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
