174186. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L 13365 antibiotikum előállítására
9 174186 10 inokulum egy literével 10 liter, tankfermentorban sterilezett, az alábbiakban megadott összetételű táptalajt oltunk be: Húskivonat Pepton Élesztőkivonat Nátriumklorid Szójaliszt Glükóz Kalciumkarbonát Csapvíz 4 g/1 4 gA 1 gA 2,5 gA 10 gA 5 gA 0,5 gA egy literre feltöltve A fermentációt 28 °C és 30 °C között levegőztetett körülmények között, keverés közben végezzük. Az antibiotikum-aktivitást núkrobiológiailag, agar-diffúziós módszerrel, tesztorganizmusként Staphylococcus aureus törzset használva határozzuk meg. A legnagyobb biológiai aktivitást a fermentáció 72—96. órája után érjük el. részére töményítjük az oldatot, majd 4 °C hőmérsékletre hűtjük. A kivált csapadékot összegyűjtjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, amikor a spektrofotometriás mérés szerint 80%-os tisztaságú 5 L13 365 antibiotikumot kapunk, a termék súlya 0,450 g. A fentiek szerint előállított anyagokat tovább tisztítjuk. Ezért kloroform és metanol 85 :15 arányú elegyének lehető legkisebb mennyiségében old- 10 juk az anyagot, majd szilikagélből és celitből (1 :1 arányú keverék), előzőleg 100 °C hőmérsékleten aktivált és a fenti kloroform és metanol eleggyel mosott kromatografáló oszlopon kromatografáljuk az oldatot. 15 Az oszlop eluálásához és az elúció ellenőrzésére végzett vékonyrétegkromatográfiához ugyanezt az elegyet használjuk. A vékonyrétegkromatogram alapján egyesített frakciókat csökkentett nyomáson desztilláljuk. A kis mennyiségű desztillációs mara- 20 dékhoz dietil-étert adunk, amikor 95%-os tisztaságú (spektrofotometriás mérés) L 13 365 antibiotikum válik ki az oldatból. A terméket metanol és etilacetát 1 :1 arányú elegyében oldjuk, az oldatot 45 °C hőmérsékletűre melegitjük fel és szűrjük. A 25 szürletet 4 °C-ra hűtjük, és ezen a hőmérsékleten hagyjuk állni egy éjszakán át, amiután világossárga színű, tűkristályokból álló termékként tiszta L13 365 antibiotikumot kapunk. 2. példa Az L 13 365 antibiotikum elkülönítése és tisztítása 80 liter, az 1. példában megadottak szerint előállított tenyészlevet 1% clarcel szűrési segédanyag jelenlétében szűrünk. A szűrési maradékban levő micéliumokat kidobjuk, a szűrt lé pH-ját 10%-os hidrogénklorid oldattal 2,5-re állítjuk be, majd az eredeti térfogat felének megfelelő mennyiségű etilacetáttal kétszer extraháljuk. Nagy fordulatszámú centrifugán elkülönítjük a szerves fázist a vizestől, nátriumszulfát jelenlétében vízmentesítjük, 45 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten, csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval eredeti térfogatának 1/300-ad részére koncentráljuk, végül 0°C és 10 °C közötti hőmérsékletre hűtjük. A hűtéskor nyers csapadék válik ki, amit szűréssel elkülönítünk, kis mennyiségű etilacetáttal mosunk, és 45 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson desztillálunk. így 1,140 g, a spektrofotometriás mérés szerint 70%-os tisztaságú L 13 365 antibiotikumot kapunk. A szűréskor kapott anyalúgot 20 térfogat petroléterbe öntjük, amikor további, 2,550 g mennyiségű, a spektrofotometriás meghatározás szerint 20-25%>os tisztaságú antibiotikumot kapunk. Ezt az anyagot metanol és aceton 9 :1 arányú elegyének kis mennyiségébe szuszpendáljuk, a szuszpenziót szűrjük, a szűrletet vízzel hígítjuk. Keverés közben 10%-os hidrogénklorid oldattal 2,5-re állítjuk be az oldat pH-ját, az oldatból kiváló csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és a lehető legkisebb mennyiségű, 45 °C és 50 °C közötti hőmérsékletű butanolban oldjuk. Csökkentett nyomáson kivitelezett desztillálóval az eredeti térfogat 1/5 30 A találmány szerinti eljárással előállított L 13 365 antibiotikum világossárga színű, kristályos anyag, amely savas jellegű. Ha az L 13 365 antibiotikumot 6 n hidrogénkloridban, leforrasztott és 110 °C hőmérsékletre melegített csőben hidrolizál- 35 juk, úgy 4 aminosavat kapunk, amelyek közül 3, az aminosav-analizátorral végzett mérések szerint aszparaginsav, treonin és glicin. A találmány szerinti eljárással előállított L13 365 antibiotikum a fentieken kívül a következő tulajdonságokkal ren- 40 delkezik: 1. Olvadáspont: 210 °C. 2. Elemösszetétel: szén: 51,35, hidrogén: 5,05, nitrogén: 10,50, kén: 11,05, oxigén (a különbség alapján): 22,05%. 45 3. Ultraibolya és látható fényben vizsgált abszorpciós spektrum: Oldószer KA ^m»x (ni*0 eJ% clcm Hidrogénklorid, 0,1 n 360 103 290 (váll) 237 326 55 0,15 M puffer 408 (váll) pH 7,5 378 67 290 (váll) 237 326 60 0,15 M puffer 408 99 pH 8,8 290 (váll) 238 336 Az ultraibolya abszorpciós spektrumot UNICAM 65 Sp 800 ultraibolya spektrofotométerrel, metil-5
