174127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
9 174127 10 zulinban, gyakran részben kicsapódnak semleges pH-n. Ezek a szennyezó'dések gyalaan tartalmaznak inzulin-bontó enzimeket, mint amilyen a tripszin és a kimotripszin, melyek az inzulin készítmény hatását csökkentik. A tisztább cink-inzulin lehetővé 5 teszi kiterjedt hatású sertés és marha inzulin készítmények előállítását az eddig kívánatos további tisztítás nélkül. Végül a tisztább cink-inzulinból készített izofán-inzulin előállításához kevesebb protamin szükséges, mivel a savas fehérje 10 szennyeződések távolléte lehetővé teszi, hogy csak olyan mennyiségű protamint használjunk, amely az inzulin kicsapásához szükséges. Az eljárást kívánt esetben egyéb tisztítási eljárásokkal kombinálhatjuk. Például az alkálifém- vagy 15 ammónium-inzulin oldatot a gél-szűrés előtt egy vagy több szűrési műveletnek vethetjük alá. Az eluált inzulint a cink-inzulinná alakítás előtt szintén alávethetjük egy vagy több szűrési műveletnek. 20 1. példa 5% vízfelvevőképességgel és 20—80 p részecskemérettel rendelkező térhálós dextrán gélt 0,5 n ecetsavval egyensúlyba hozunk. Egy 10 cm kereszt- 25 metszeti átmérőjű és 100 cm hosszú K 100/100 típusú laboratóriumi oszlopot (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) 7 liter agytérfogatig (ágy mélység: 89 cm) megtöltünk a duzzasztott géllel. 17,5 g marha pankreászból származó nátrium-inzulint, melyet a 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás eljárása szerint állítottunk elő és melynek a hatóképessége 23,8 egység/mg és proinzulin tartalma 4,21 súlyszázalék, 400 ml 0,5 n ecetsavban oldunk. Az inzulin-oldatot az oszlopra visszük és 0,34 atm nyomáson 0,5 n ecetsavval eluáljuk, mely 900 n l/óra átfolyási arányt eredményez (lineáris átfolyási arány: 0,19 ml/cm2/perc). További 1725 ml-rel eluálunk, minden egyes, körülbelül 23,5 ml-es térfogatot összegyűjtünk, a fehérje tartalmat ultraibolya abszorpcióval 280 mp-nál történő méréssel határozzuk meg. A tisztaságot az egység/mg hatóképesség alapján határozzuk meg (kb. 28 egység/mg felel meg 100%-os tisztaságnak). A mg/ml-ben mért szilárd anyag koncentrációt szintén meghatározzuk, összesen 240 frakciót gyűjtünk. A frakciókat négy csoportba egyesítjük, amint ezt a következő táblázatban szemléltetjük: Csoport Térfogat ml Frakciók Az összes eluát szilárd anyaghoz viszonyított szilárd anyag % Azonosítás A 1405 10-69 1,4 nagy molekulasúlyú fehérjék és enzimek B—1 1193 70-119 2,4 elsősorban proinzulin B-2 978 120-160 9,7 proinzulin és inzulin C 1520 161-225 86,4 inzulin A C-csoporthoz 3,0 ml 20%-os cinkklorid-oldatot 40 adunk és a kapott oldatot 0,5 n ammóniumhidroxid-oldattal 3025 ml térfogatra hígítjuk. A végső oldat pH értékét hig ammóniumhidroxid-oldattal 6,0 értékre állítjuk. A kivált cink-inzulint centrifugálással elkülönítjük és egymás után vízzel, 45 abszolút alkohollal és éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A cink-inzulin kitermelése 13,9 g, az inzulin hatóképessége 25,6 egység/mg és proinzulin tartalma 0,44%. Mivel a C-csoport szilárd anyag tartalma az 50 összes eluált szilárd anyag 86,4%-a, a C-csoportból kapható maximális mennyiségű szilárd anyag a 17,5g-nak a 86,4%-a, azaz 15,1 g, hatóképességre számolva a maximális kitermelés körülbelül 360 000 egység. így a C-csoportból előállított cink- 55 -inzulin kitermelése 91,9% a súlyra és 98,9% az egységre számítva. A kiindulási anyagra vonatkoztatva ez 79,4%, illetve 85,4%-nak felel meg súlyra, illetve az egységre vonatkoztatva. A B-2 csoportot a C-csoportnál leírt módon 60 fölöslegben levő mennyiségű cinkionokkal csapjuk ki, 0,5 n ecetsavban újra oldjuk és egy kisebb oszlopon újra szűrjük. Az inzulint a C-csoportnál leírt módon átkristályosítjuk, így további 1,0 g cink-inzulint állítunk elő, melynek hatóképessége 65 26,7 egység/mg. így a kiindulási anyagra számított cink-inzulin összkitermelése: 85,1% a súlyra és 91,8% az egységre számítva. Az 1. példában leírt eljárás jobb megértése céljából utalunk a mellékelt ábrára. Az ábra az 1. példa eluációs diagramja, azaz az összes frakció 280 nvr-nál mért optikai sűrűsége a frakció számok ellenében. Így a diagram mutatja az eluálás folyamán összegyűjtött frakciók fehérje tartalmát. Az 1. példában leírt, a különböző frakciók néhány csoportba történő gyűjtését a jelzett függőleges vonalak mutatják. A diagramból kitűnik, hogy a kiindulási anyag lényegileg inzulinból ál és hogy az inzulin komponenst hatásosan elkülönítjük a proinzulintól és hasonló fehérjéktől. 2. példa Az 1. példában leírt eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy a marha nátrium-inzulin helyett 30 g sertés nátrium-inzulint hasznáunk és az 0,5 n ecetsav mennyiségét, melyben az inzulint oldjuk 600 ml-re növeljük. A sertés nátrium-inzulin hatóképessége 23,3 egység/mg és a proinzulin tartalma 2,42 súlyszázalék. Az alábbiakban következő eredményeket kaptuk: 5
