174127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
7 174127 8 A IQ koefficienssel valamely oldott anyag Ve eluálási térfogata a következő egyenlettel fejezhető ki: Ve = V0 + Kd • V, mely egyenletben V0 az oszlop üres térfogata és V, a felszívódott oldószer térfogata. Az egyenletet Kd-re megoldva a következő eredményt kapjuk: Vi Ha a víz sűrűségét egységesnek feltételezzük Vi = a • Wr ahol „a” a száraz gél súlya és Wt a felvett víz mennyisége. így Kd-re a következő összefüggés adódik: ve-v0 Kd—a^wT amelyet szakember kísérletileg meghatározhat. Ha azt feltételezzük, hogy az oldat két oldott anyagot tartalmaz, az eluálási térfogatot mindkét oldott anyagra nézve a következőképpen fejezzük ki: V’e = Vo + Kd* • Vi V”e = V0 + K”d • Vi A V, elkülönítési térfogat a két oldott anyag eluálási térfogatának a különbsége: V, = V”e - V’e V,=(K”d-K’d)Vi Az előzőkből az következik, hogy két vagy több oldott anyag elkülönítési foka részben az oszlop töltetétől függ. Ahogyan az alacsony molekulasúlyú oldott anyag mérete megközelíti az elérhető pórusok méretének a határát, a két oldott anyag szükségszerűen csökkenő mértékben különül el egymástól. A találmány szerinti eljárás részeként előírt töltethatárokon belül az elkülönítés foka változhat. Néhány esetben magasabb oszlop töltetett választhatunk, hogy kiegyenlítsük az elkülönítés és a termelékenység viszonyát. Amint azt már fent említettük, az eluáló közeg pH-ja körülbel 2,0 és körülbelül 3,5 közötti értéktartományban van. Általában az eluáló közeg bármely szervetlen vagy szerves sav vizes oldata lehet, melyekkel szemben a fehérjék stabilak. Ilyen savak többek között például a sósav, foszforsav, hangyasav, ecetsav, propionsav, n-vajsav, izovajsav, valeriánsav és hasonlók. Előnyös sav az ecetsav. Ha sósavat alkalmazunk, akkor az eluáló közegnek egy tartósítószert, mint amilyen a fenol, kell tartalmaznia. Meg kell jegyeznünk, hogy az ecetsav tartósítószerként hat. Az előnyös pH érték körülbelül 2,5. Ebből következik, hogy a legelőnyösebb eluáló közeg az 0,5 n ecetsav-oldat. Kívánt esetben az eluáló közeg legfeljebb körülbelül 0,02 mól/liter mennyiségben szervetlen sókat, mint amilyen a nátriumldorid, káliumklorid, ammóniumklorid és hasonlók, tartalmazhat. Előnyös koncentráció a 0,01 mól és előnyös só a nátriumklorid. A fenti sók alkalmazása előnyös a feloldás elősegítésére és annak megakadályozására, hogy a bázikus anyagok a gélen abszorbeálódjanak. Az oszlop eluálását körülbelül 5 °C és körülbelül 30 °C közötti hőmérséklettartományban végezhetjük. Az eljárás hőmérséklete előnyösen a környezet hőmérséklete vagy ennél alacsonyabb érték. Az eluálást bármely szokásos módszer szerint hajthatjuk végre. Egy különösen hasznos módszernek bizonyult azonban az, mely szerint minden egyes frakciót ultraibolya abszorpcióval 280 nyr-nál mérünk. Azokat a frakciókat, melyek a kívánt tisztaságú inzulinból állnak egyesítjük és rendszerint cink-inzulinná alakítjuk. Amint azt fent említettük, a cink-inzulin a legjelentősebb formája az inzulinnak. Ebből következik, hogy a fenti eljárással előállított nagytisztaságú alkálifém- vagy ammónium-inzulint rendszerint cink-inzulinná kell átalakítani. A cink-inzulinná történő átalakítást előnyösen 6,0 pH értéken ammóniumacetát puffer jelenlétében végezzük. A cinkkel történő kristályosítás előtt nem szükséges az alkálifém- vagy ammónium-inzulint az eluáló közegtől elkülönítenünk vagy a tisztított inzulin-oldatát betöményí tenünk. A találmány szerinti eljárás egyik előnye abban rejlik, hogy az eluált inzulin-oldat elegendő tömény, így a kisózás vagy az izoelektromos kicsapás szükségtelen, bár kívánt esetben ezek a műveletek is elvégezhetők. Az így előállított cink-inzulin a találmány szerinti eljárás eredményeképpen tökéletesebb tisztaságú. Ezt a tökéletesebb tisztaságot néhány módszerrel bebizonyíthatjuk. A cink-inzulint közvetlenül a nem-inzulin fehérje komponensekre, mint amilyen a proinzulin és a glukagon, analizálhatjuk. A nagy molekulasúlyú fehérjék, amelyek jellegzetesen protandnázt, egy proteolitikus enzimet tartalmaznak, jelenlétét úgy határozhatjuk meg, hogy emelt hőmérsékleten megmérjük a protamin-inzulin szuszpenzió stabilitását, ha protamináz van jelen, a protamin-inzulin komplex a protamin lebomlása miatt disszociál. Mérhetjük a fizikai tulajdonságokat, például a cink-inzulin oldhatóságát semleges pH-n és az így kapott oldat színét. Végül az inzulin specifikus aktivitását biológiai és immunológiai vizsgálatokkal mérhetjük. A találmány szerinti eljárással előállított megnövelt tisztaságú cink-inzulint kiválóan alkalmazhatjuk az inzulin különböző gyógyászati formáinak, mint amilyen a szabályszerű inzulin, izofán-inzulin, protamin-cink-inzulin, cink-inzulin szuszpenzió, globulin-inzulin és hasonlók, elkészítésére. A tisztább cink-inzulin továbbá lehetővé teszi, hogy semleges inzulint készítsünk, mely stabilabb a savas inzulinnál, azok a szennyeződések, melyek jelen vannak a dnk-in-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
