174127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
5 174127 6 (1. példa) cink-inzulint szűrtek át térhálós gél oszlopon 80%-os kitermeléssel. Az eluáló oldószer 1,0 mólos ecetsav volt. Meg kívánjuk jegyezni, hogy Schlichtkrull és munkatársai szükségesnek tartották, hogy szűrés után kisózást, izoelektromos kicsapást és eink kristályosítási műveleteket végezzenek a cink-inzulin előállítása céljából. Az inzulin tisztítására korábbi módon alkalmazott gél-szűrési eljárások mindegyike lényeges inzulin veszteséget eredményez. Továbbá, a korábbi alkalmazásokból semmi hitelt érdemlő jelzés nincs arra vonatkozóan, hogy a gél-szűrés használata eredményeképpen csak inzulint (beleértve az inzulin-típusú fehérjéket, amint azt fent említettük) nyernek ki. A találmány szerinti eljárásban általában bármely, fehérje oldatokkal való használatra alkalmas vízzel duzzasztható gélt használhatunk. Azonban ennek a gélnek száraz vagy nem duzzasztott állapotban a száraz gél súlyára vonatkoztatva legalább körülbelül 4 súlyszázalék vizet kell visszatartania és körülbelül 100 mikronnál kisebb részecske átmérővel kell rendelkeznie. A gél vizet visszatartó képessége előnyösen körülbelül 5-20 százalék tartományba esik. A száraz gél részecskék átmérője előnyösen kisebb, mint körülbelül 80 mikron, a részecske méret különösen hasznos tartománya körülbelül 20—80 mikron között van. Az alkalmas gélek többek között például a következők: keményítő (beleértve a kukorica keményítőt), térhálós galactomannon, kereszthálósított dextrán, agar-agar vagy agaróz, poliacilamidok, acilamid és metilén-bisz-akrilamid kopolimerek, a metilén-bisz-akrilamidonak viniletil-karbitollal és vinil-pirrolidonnal alkotott polimeijei és hasonlók. Előnyös gélek a térhálós dextránok, mint amilyenek a „Sephadex” sorba tartozók, melyeket a Pharmacia Fine Chemicals, Inc. Piscataway, N.Y. USA. gyárt és hoz forgalomba. Az eljárásban alkalmazott oszlop típusa nem jelentős. Az oszlop hosszának, átmérőjének vagy konfigurációjának a megválasztása a kívánt műveleti paraméterektől függ. Természetesen az oszlop magasságának növekedésével az átfolyási arány csökken, ha az oszlopot különbözően helyezzük el az oszlop ellennyomása egyenesen arányos az oszlop magasságával. Ezért a felállított oszlop konfigurációt részesítjük előnyben, mint amilyen a „Pharmacia Sectional Colunn. KS—370.” Átlagos eljárási célokra a hat szekcióból álló oszlop halmaz kielégítő. Közelebbről kielégítő inzulin tisztítást olyan töltött oszlopon hajthatunk végre, amely körülbelül 4,5 gramm alkálifém- vagy ammónium-inzulint tartalmaz 1 liter ágytérfogatú oszlop töltetre vonatkoztatva, ez a legelőnyösebb. Azonban ez általában körülbelül 0,5—6,7 gramm, előnyösen azonban körülbelül 3,5-5,0 gramm tartományba eső mennyiséget tartalmazhat 1 liter oszlop töltetre vonatkoztatva. Természetesen bármely adott oszlop számára könnyen meghatározhatók az optimális feltételek. A gélt duzzasztjuk és az oszlopot a szakember számára ismert különféle módszerek bármelyike szerint megtöltjük. A gélt általában az eluáló közegben duzzasztjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a gélt 30 százalékos vizes etanolban duzzasztjuk, ezután dekantálunk és a duzzasztó közeget az eluáló közeggel helyettesítjük. Az alkálifém- vagy az ammónium-inzulin oldatot bármilyen szokásos módon elkészíthetjük. Például az inzulint meghatározott mennyiségű eluáló közegben oldhatjuk fel. Vagy az inzulint olyan vizes közegben oldjuk, mely kissé savasabb, mint az eluáló közeg (de még az eluáló közeg pH tartományán, vagyis 2,0-3,0 pH tartományon belül van). Például, ha az eluáló közeg 2,5 pH-jú 0,5 n ecetsav, az inzulint 2,3 pH-jú vizes közegben, azaz 1,0 n ecetsavban oldhatjuk. Az alkálifém- vagy az ammónium-inzulin általában alkalikus illetve bázikus természetű. Az inzulin semleges vagy savas vizes közegben történő oldását követően a kapott oldat pH értéke emelkedik. így, ha az inzulint 1,0 n ecetsavban oldjuk, a kapott oldat pH értéke körülbelül 2,7-re emelkedik. Azonban az alkalmazott inzulin koncentrációjától függően az inzulin oldat pH-ja még a 3,2-es értéket is elérheti. Ez a PH növekedés normális és nem okoz semmi problémát, ha az inzulin-oldat körülbelül 3,5-os értéket nem haladja meg. Egy másik módszer szerint az inzulint 0,5 n ecetsavban oldhatjuk és az oldat pH értékét híg sósavoldat hozzáadásával maximum körülbelül 3,2-re állítjuk be. Általában az alkálifém- vagy ammónium-inzulint bármely ismert módszer szerint előállíthatjuk. Az alkálifém- vagy ammóniuminzulint előnyösen azonban a 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint készítjük. Mint azonban már fent említettük az inzulinnak legalább körülbelül 80 százalékosnak kell lenni. Ez azt jelenti, hogy az inzulin tartalomnak, beleértve a hipoglikémiás aktivitással rendelkező inzulin-típusú fehérjéket, az összes fehérjéhez képest legalább körülbelül 80 százalékban kell jelen lennie. Az alkálifém- vagy ammónium-inzulinnak az oszlopban alkalmazott inzulin-oldatban levő koncentrációja, mint már fent említettük, körülbelül 1-8 súly/térfogat százalék. Előnyös koncentráció a körülbelül 4-6 százalék közötti érték. Ahhoz, hogy kielégítő eredményt kapjunk, az alkálifém- vagy ammónium-inzulint olyan térfogatú oldószerben kell feloldanunk, mely a később tárgyalt elkülönítési térfogatnál kisebb. A kromatográfiában a Kd-vel jelzett megoszlási koefficienst az oldott anyag mozgó fázisban és álló fázisban levő koncentrációjának az arányával határozzuk meg. A gél-szűrésben a mozgó fázis az az oldószer, mely a gél részecskék közötti üres térben mozog és az álló fázis az az oldószer, melyet a gél részecskék magukba szívtak, azaz minden egyes gél részecske pórusában elkülönültek. így a Ki a felszívódott oldószer azon hányadát fejezi ki, amely az oldott anyagon áthatol. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
