174117. lajstromszámú szabadalom • Eljárás chinosporin C antibiotikum izolálására
5 174117 6 6,27 mg/ml-re esett vissza, ami 2 m1 * 3-es fermentorba való bekeverésnél 2,6 mg/ml-re csökkent tovább. A 3. példa egy ilyen eljárást mutat be. Jól szemlélteti az eljárás előnyös voltát az antibiotikumot tartalmazó oldat-térfogatnak 1300 literről 1 literre való lecsökkentése, és a kinyerésnél elért mintegy 30%-os kitermelés a nagy tisztaságú porra vonatkoztatva. A nagy tisztaságú termék analitikai adatai: Akut toxicitás: a termék nem toxikus. Elemanalízis: C = 35,8%, H = 6,0%, N = 16,28%, a (összes) = 16,37%, S = 3,8%. Olvadáspont: a termék melegítve olvadás nélkül bomlik. A termék jellemzésére megadjuk az UV és az IR spektrumokat. (A csatolt spektrumok több sarzs fermentlé feldolgozása során kapott terméken felvéve sem mutattak eltérést, ami az eljárásunkkal kapott termékek megegyező voltát bizonyítja.) Rétegkromatográfiás adatok: üveg hordozóra felvitt cellulóz por hordozón etilacetát : piridin : ecetsav : desztillált víz = 15 : 20 :6 :11 összetételű futtatószerrel vizsgálva az anyag egyetlen foltot ad Rf=0,45 értékkel. Az anyag UV fényben fluoreszkál. A találmány szerinti eljárás részleteit az alábbi kiviteli példák szemléltetik a találmány korlátozásának szándéka nélkül. 1. példa 50 liter 270 7/m1 Chinosporin C tartalmú, Bacillus coagulans (0099 sz. O.K.I.-néi deponált törzs) alkalmazásával nyert fermentlé pH-ját 96%-os ecetsavval 5,2-re állítjuk be állandó keverés közben. A fermentlébe 1 liter, 5,2 pH-jú foszfát pufferrel ekvilibrált, a 165 669 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint készített gyantát adunk (Chinoin, Budapest), és a keverést +5 és +25 °C közötti hőmérsékleten 1,5 órán keresztül folytatjuk. A keverés leállítása után a gyanta 5 perc alatt leülepszik. Ekkor a felülúszót leszívatjuk és elöntjük. A gyantát egy 3 literes G—1-es üvegszűrőre visszük. Az elöntött felülúszóban a mért aktivitás 23 7/ml. Az üvegszűrőn levő gyantát vákuumos átszívatás mellett 3x1 liter desztillált vízzel átmossuk, majd 2x1 liter 1 n sósav-oldattal elvégezzük az eluálást. Az eluátumokat 60%-os nátrium-hidroxid-oldattal azonnal semlegesítjük, majd egyesítjük. Az ekkor mérhető aktivitás 6115 7/ml. Az 5,2 pH-értékre beállított eluátumot 1,5 cm átmérőjű kromatografáló csőben levő 20 ml, 5,2 pH-ra ekvilibrált gyantán +4 és +25°C között, előnyösen +4 °C-on, 1,5—2 ml/perc sebességgel átengedjük. Az elfolyó oldat aktivitása 103 7/ml/ A teljes eluátum-térfogat átfolyása után az oszlopot 4 x 20 ml, 8 pH-jű, 0,1 mólos foszfát pufferrel átmossuk, majd 4 x 20 ml 1 n sósav-oldattal elvégezzük az eluálást. 4 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket azonnal trietilanúnnal semlegesítünk. A mosófolyadékokban mért antibiotikum-tartalom: Frakció sorszám Frakció térfogat Aktivitás 1. 17 ml 49 7/ml 2. 18 ml 24 7/ ml 3. 18 ml 38 7/ml. Az eluátumok antibiotikum-tartalma: Frakció sorszám Frakció térfogat Aktivitás 1. 18 ml 1525 7/ml 2. 19 ml 136000 7/ml 3. 25 ml 192000 y/ml 4. 19 ml 1100 7/ml. A 2. és a 3. frakciót egyesítjük, és kétszeres mennyiségű abszolút etanolt adunk hozzá. Csapadék válik ki, amit G—3 jelű üveg szűrőn kiszűrünk. Ez a csapadék antibiotikumot nem tartalmaz. A szűrlethez háromszoros térfogatú acetont adunk, a keveréket egy éjszakán át +4 °C-on állni hagyjuk, ezután szűrjük és a csapadékot vákuumban 3 órán át szárítjuk. 935 mg port kapunk, amely a korábbi munkastandardhoz képest 5,7-szeres aktivitást mutat. így az eredeti fermentlé aktivitására számolt kitermelés 37,5%. 2. példa Mindenben az 1. példában leírtak szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy Duolit CS 100 jelű (Chemical Process Co, USA) fenol típusú gyantát használunk, melynek nedves kapacitása 0,8 mekv/ml, száraz kapacitása pedig 1,9 mekv/g. A gyantának a fermentlébe való bekeverése után a felülúszóban az aktivitás 71 y/ml-re csökken. Az első eluálásnál az eluátum második literében jelentkezik a biológiailag aktív anyag, ezért 3 liter 1 n sósavoldattal végezzük az eluálást, és a 2. és 3. liter eluátumot egyesítjük. Ezen egyesített oldat aktivitása 4270 7/ml. Az újbóli oszlopravitel során az elfolyó oldat aktivitása 380 7/ml. A gyanta mosófolyadékának aktivitása: Frakció szám Frakció térfogata Aktivitás 1. 19 ml 29 7/ml, 2. 17 ml 17 7/ml, 3. 20 ml 15 7/ml. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
