173716. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-difluormetil- 6,7-metiléndioxi-1,4-dihidro-4-oxo-3-kinolinkarbonsav és észtereinek előállítására
5 173716 6 A parenterális úton adagolható oldatok hordozóanyagként rendszerint vizet, megfelelő olajokat, fiziológiás sóoldatot, vizes glükóz-oldatot, hasonló vizes cukoroldatokat, továbbá glikolokat, így propilénglikolt vagy polietilénglikolt tartalmazhatnak. Parenterálisan adagolható oldatok előállításához előnyösen az (I) általános képletű hatóanyagok vízben oldódó sóit használjuk fel. E készítmények adott esetben stabilizálószereket, például antioxidánsokat (így nátrium-biszulfitot, nátrium-szulfitot és/vagy aszkorbinsavat), továbbá citromsavat, citromsav-sókat vagy etiléndiamin-tetraecetsav-nátriumsót tartalmazhatnak. A parenterálisan adagolható készítményekhez szükség esetén pufferanyagokat, továbbá konzerválószereket, így benzalkónium-kloridot, metil- vagy propil-parabént vagy klórbutanolt is adhatunk. A gyógyászati készítmények előállításához felhasználható hordozó- és segédanyagokat a Remington’s Pharmaceutical Sciences című szakkönyv (kiadó: E. W. Martin) részletesen ismerteti. A következőkben az l-difluormetil-6,7-metiléndioxi-l,4-dihidro4-oxo-3-kinolinkarbonsav [(la) képletű vegyület] mikrobiológiai és farmakológiai vizsgálatait és e vizsgálatok eredményeit ismertetjük. A) Minimális gátló koncentráció (MGK) meghatározása in vitro körülmények között A vizsgálatokat ismert sorozathígításos módszenei végeztük. Az 1. táblázatban felsorolt baktériumtörzsek törzstenyészeteit megfelelő táptalajon egy éjszakán át 37 °C-on végzett tenyésztéssel alakítottuk ki, majd a törzstenyészetből előre meghatározott koncentrációjú vizsgálandó mintákat készítettünk. A mintasorozathoz 10, 2, 0,4, illetve 0j08 /Lfg/ml mennyiségű (la) képletű vegyületet adtunk, majd a rendszereket 18 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezután megvizsgáltuk a baktériumok növekedését, és az eredményeket feljegyeztük. Azt a legkisebb hatóanyagmennyiséget, amely még meggátolja a baktériumok növekedését, minimális gátló koncentrációnak tekintjük. Az így meghatározott minimális gátló koncentráció-értékeket az 1. táblázatban közöljük. B) In vivo körülmények között végzett biológiai vizsgálatok 1. Escherichia coli elleni hatás vizsgálata Körülbelül 20 g testsúlyú fehér nőstény egereknek intraperitoneális injekcióban Escherichia coli baktériumsejteket adtunk be. A megfertőzéshez a baktériumsejteket olyan mennyiségben használtuk fel, amely a kezeletlen állatok esetén a megfertőzést követő harmadik napig 85—100%os pusztulást okoz. 12 egérnek a megfertőzéssel egyidőben, majd 4 óra elteltével orálisán, szondán keresztül 40 , 20, 10, illetve 5 mg/kg mennyiségű (la) képletű vegyületet adtunk be. Az egereket 72 órán át tartottuk megfigyelés alatt, majd az észlelt eredményekből Reed és Muench módszerível [Am. J. Hygiene 27, 493—497 (1938)] kiszámítottuk az (la) képletű vegyület ED50-értékét. Az észlelt eredményeket a 2.táblázatban közöljük. 2. Staphylococcus aureus elleni hatás vizsgálata A vizsgálatokat az előző bekezdésben közöltek szerint hajtottuk végre, azzal a különbséggel, hogy az (la) képletű vegyületet 400 , 200, 100, illetve 50 mg/kg dózisban használtuk fel. Az ED50-értékeket a 2.táblázatban közöljük. C) Általános farmakológiai szűrővizsgálatok A vizsgálatokat 16-20 g testsúlyú fehér nőstény egereken, illetve 70-90 g testsúlyú patkányokon végeztük. Az állatokat 17-24 órára kikötöttük, majd az állatoknak orális úton 0, 4, 12, 36, 108, illetve 324 mg/kg vizsgálandó hatóanyagot adtunk be. Egerek esetén a hatóanyag beadását követő 0,5, 2, 5, illetve 24 óra elteltével meghatároztuk a pusztulási arányt, vizsgáltuk az állatok mozgásának koordinációját, testhőmérsékletét, ingerelhet őség ét és izgalmi állapotát. Ugyanakkor az állatok étvágyának változását is feljegyeztük. Patkányok esetén a hatóanyag beadását követő 1, 2, 4, 6, illetve 24 óra elteltével hajtottuk végre a fenti vizsgálatokat, a patkányok étvágyának változását azonban nem kísértük figyelemmel. A mozgás koordináltságának vizsgálata a) Ataxia vizsgálata Az állatokat emelvényre állítottuk, és az állatok mozgását hátulról figyeltük. Ataxiás jelként értékeltük az állatok rendellenes járásmódját, illetve a célirányos mozgás esetén észlelhető rendellenes mozdulatokat. A spontán nem mozgó állatokat enyhe döfésekkel készleltettük mozgásra. Az észlelt adatokból kiszámítottuk a hatóanyagok ED50-értékét. b) Mozgás függőleges rúdon Az állatokat farkuknál fogva egy ragasztószalaggal bevont függőleges rúd mellett meglengettük. Egerek esetén 1,3 cm, patkányok esetén 2,6 cm átmérőjű rudat használtunk, a rúd hosszúsága minden esetben 30,5 cm volt. Pozitív jelként értékeltük, ha az állatok mellső lábaikkal nem tudták elkapni a rudat, a rúdon lecsúsztak, vagy kis döfés után sem mozogtak. Az észlelt adatokból kiszámítottuk a hatóanyagok EDS0-értékét. Testhőmérséklet vizsgálata Az állatok testhőmérsékletét KC-1 típusú termoelemmel mértük az állatok végbelénél. Az észlelt értékeket a kontroli-csoportra meghatározott hőmérsékleti értékekkel vetettük egybe. Hipotermiára utaló jelként értékeltük, ha az állatok testhőmérséklete a kontroli-csoportra meghatározott átlagértéknél legalább a standard deviáció kétsze-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
