173702. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-N-(alfa-hidroxi-omega-aminoalkanoil)-6'n-metil-3'-4'-didezoxi kanamicin B előállítására
17 173702 18 hozzáadjuk 960 mg (4 millimól) terc-butil-S-4,6-dimetilpirimid-2-il-tiokarbonát 5 ml dioxánnal készített oldatát. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Ekkor szilárd maradékot kapunk, amelyet 40 ml vízben felveszünk és az oldhatatlan anyagot szűréssel elkülönítjük. Az oldatot (a szűrletet) 100 ml Amberlite CG 50 (NH4 -forma) kationcserélő gyanta-oszlopon (20,290 mm-nél) átengedjük annak érdekében, hogy a terc-butoxikarbonilezés termékét megkössük a gyantán adszorpció útján. A gyanta-oszlopot 500 ml vízzel mossuk és utána 0,1 n vizes ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk. Az eluátum azon frakcióit, amelyek pozitivok a ninhidrin-reakcióra és a Rydon-Smith-reakcióra és amelyek 0,60 Rf-nél nagy foltot adnak vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnál szilikagélen (4 : 5 :2 : 3 tf arányú) butanol-etanol-kloroform 17%-os ammóniumhidroxid-oldat eluálószer használata esetén, egyesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Ily módon 538 mg színtelen port kapunk, amely legnagyobb részben 2’N,6’N-dí-terc-butoxikarbonil-6’N-metil-3’,4’-didezoxikanamicin B. Kitermelés 41%. b) 100 mg (0,15 millimól) ily módon kapott színtelen port, amely főként 2’N,6’N-di-terc-butoxikarboml-ó’N-metil-S’,4’-didezoxikanamicin B-t tartalmaz, 1 ml víz és 1 ml dimetoxietán elegyében oldunk és a keletkező oldathoz hozzáadjuk 54 mg (0,17 millimól) L-4-terc-butoxikarbonilamido-2-hidroxivajsav-N-hidroxiszukcinimidészter 2 ml dimetoximetánnal készített oldatát. Az elegyet 22 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük annak érdekében, hogy az aminovédett 6’N-metil-3’,4’-didezoxikanamicin B acilezését elvégezzük. A reakcióelegyet ezt követően csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, ily módon szilárd maradékot k'Hmnk, amely az N-védett 6’N-metil-3’,4’-didezoxiktnamicin B anyag N-acilezett származékainak az elegye. c) Az előző b) lépésben kapott szilárd maradékot 2,4 ml 90%-os vizes trifluorecetsavban oldjuk és az oldatot 1 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk a terc-butoxikarbonil-csoport eltávolítása érdekében. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és a maradékot 4 ml vízben felvesszük. Az oldat pH-ját tömény, vizes ammóniumhidroxiddal 8-as értékre állítjuk és utána 20 ml Amberlite CG 50 (NH4 -forma) kationcserélő oszlopon (8, 400 mm-nél) átengedjük avégett, hogy a kevert N-acilezett 6’N-metil-3’,4’-didezoxikanamicin B termékeket a gyantán adszorbeáltassuk. Ezután a gyanta-oszlopot egymást követően 100 ml vízzel, 100 ml 03 n vizes ammóniumhidroxiddal, 0,5 n vizes ammóniumhidroxiddal mossuk, majd a gyanta-oszlopot 0,75 n vizes ammóniával eluáljuk. Az eluátumot 2 ml-es frakciókban felfogjuk és a szokásos lemez-módszerrel meghatározzuk az egyes frakcióknak a Bacillus subtilis PCI 219 kanamicin-érzékeny törzzsel és az Escherichia coli JR66/W677 kanamicin-rezisztens törzzsel szembeni aktivitását. Azokat a frakciókat, amelyek nagyfokú baktériumellenes hatást tanúsítanak mindkét törzzsel szemben, egymással egyesítjük (körülbelül 26 ml) és utána ezt szárazra pároljuk. Ily módon 39 mg színtelen port kapunk, amely főként a kívánt terméket, az lN-(L-4-amino-2 -hidro xib utiril)-6 *N -metil-3 ’,4’-didezoxikanamicin B vegyületet tartalmazza. További tisztítás végett ezt a színtelen port 0,5 ml (4 :1 : 2 tf arányú) metanol-kloroform 17%-os vizes ammónia-elegyben oldjuk és a keletkező oldatot 3 g szilikagélen oszlopkromatográfiásan tisztítjuk, eluálószerként (4:1 :2 tf arányú) metanol-kloroform 17%-os vizes ammóniumhidroxid-elegyet használunk. Az eluátumot 1 ml-es frakciókként felfogjuk, amelyek közül a 46—48-as frakcióról mutatható ki, hogy egyedül 1N -(L-4-amino-2-hidroxibutiril)-6’N-metil-3’,4’-didezoxikanamicin B vegyületet tartalmaz, amely 0,38 Rf.nél egyetlen foltot ad vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnál szilikagélen („ART” 5721), eluáló szerként (4 : 5 : 2 :8 tf arányú) butanol-etanol-kloroform 28%-os vizes ammóniumhidroxid■elegyet alkalmazunk. Ezeket a frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk, ily módon 15 mg tiszta 1N -(L4-amino-2-hi droxibutiril)-6’N-metil-3 ’,4’-didezoxikanamicin B vegyületet kapunk színtelen por alakjában. Bomláspont: 158—161 °C. 2. példa 1N -(DL-izoszeril)-6 ’N -metil-3 ’ ,4 ’-didezoxikanamicin B szintézise [Olyan (I) képletű vegyület, ahol n értéke 1] a) 403 mg (0,6 millimól), főként 2’,N,6’N-di-t e r c -b utoxikarbonil -6 *N -metil-3 ’ ,4 ’-didezoxikanamicin B vegyületet tartalmazó, színtelen port, amelyet az 1/a) példa szerint állítottunk elő, 4 ml víz és 4 ml dimetoxietán elegyében oldunk. Az így kapott oldatot 221 mg (0,66 millimól) N-terc-buto x ikarbonil-DL-izoszerin-N -hidroxiszukcinimidészt er - rel keverjük. Az acilezés elősegítése érdekében az elegyet 23,5 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet ezt követően csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így szilárd maradékot kapunk, amely főként a 2’N,6’N-di-terc-butoxikarbonil-ó’N-metil-3 ’,4’-didezoxikanamicin B kevert N-acilezett termékeit tartalmazza. b) Ezt a szilárd maradékot 7,5 ml 90%-os vizes trifluorecetsavban oldjuk és az oldatot 1 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk annak érdekében, hogy a terc-butoxikarbonil-csoport eltávolitását elősegítsük. Ezután a reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, a maradékot pedig 16 ml vízben oldjuk. Az így kapott vizes oldat pH-ját tömény, vizes ammóniumhidroxid-oldattal 8-as értékre állítjuk és utána 43 ml Amberlite CG 50 (NEU -forma) kationcserélő gyanta-oszlopon (10, 560 mm-nél) átengedjük annak érdekében, hogy a kevert N-acilezett termékeket adszorbeáltassuk. A gyanta-oszlopot először 200 ml vízzel, utána 400 ml 0,3 n vizes ammóniumhidroxid-oldattal mossuk és ezt követően 0,5 n vizes ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumot 5 10 15 20 25 Mi .55 40 45 50 55 60 65 9
