173676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükopeptidek előállítására
3 173676 4 Broughton, E.S. és Scott, M.T.: Nature, New. Biol. 235, 219 (1972)] és élôsdiekkel [Nussen-zweig,R.S.: Expi. Párásítói. 21, 224 (1967)] szemben ellenállóképességet biztosítanak anélkül, hogy a kórokozó és az immunreakciót fokozó anyag között antigén affinitás lenne. Az immunreakciót fokozó anyagok továbbá emlősökön és szárnyasokon adjuváns-hatást fejtenek ki. Azt tapasztaltuk, hogy a Corynebacterium parvum törzsbeli baktériumokból immunreakciót fokozó hatással rendelkező glükopeptideket különíthetünk el. A találmány tehát emlősöknek és szárnyasoknak daganatokkal és különféle kórokozókkal szemben ellenállóképességet biztosító, immunreakciót fokozó hatású glükopeptidek előállítására vonatkozik. Ezeket a glükopeptideket a Corynebacterium parvum törzshöz tartozó, immunreakciót fokozó baktériumok sejtfalából különíthetjük el. A találmány szerint előállított és elkülönített glükopeptidek vízben, fiziológiás sóoldatban, metanolban, etanolban, fenolban, kloroformban, dioxánban, piridinben, dimetilformamidban, dietilénglikolbar. és hexánban lényegében oldhatatlanok, és infravörös abszorpciós spektrumukban 1550 és 1660 cm'1 -nél pepiid jelenlétére utaló maximum, míg 950-1100 cm'1-nél szénhidrát jelenlétére utaló, 1070 cm-1 értékű maximummal rendelkező sávrendszer jelenik meg, a 2850—2950 cm“1 huliámszám-tartományban azonban lipidek jelenlétére utaló sáv egyáltalán nem található, vagy intenzitása csekély. E glükopeptidek intravénás beadás után növelik az egerek máj- és lépsűlyát, és fokozzák a daganatos egerek túlélési idejét. A Corynebacterium parvum törzsbeii baktériumok közül különösen előnyösnek bizonyult a Wellcome cég törzsgyűjteményében CN 6134 számon és a Pasteur Intézet törzsgyüjteményében 4685 számon letétbe helyezett, korábban Corynebacterium anaerobium néven ismert [lásd például Adlam,C. és Scott, M.T.: J. Med. Microbiol. 6, 261 (1973)] species. A találmány szerinti eljárással előállítón glükopeptidek összetétele tőbe tényezőtől, így például a baktérium-sejtfalak forrásaként felhasznált törzs genetikai változásaitól és a sejtek tenyésztésére alkalmazott módszerektől függően változik. A glükopeptidek az adott elkülönítési módszerrel elérhető tisztasági fokban is különbözhetnek egymástól, az eltérések például a glükopeptidekhez kapcsolódó külső fehérjék nem teljes mértékű eltávolítására vezethetők vissza. A találmány szerint előállított glükopeptidek előnyösen 30—45%, célszerűen körülbelül 40 sűiy% szénhidrátot tartalmaznak. A glükopeptidek mikroelemzés alapján - száraz súlyra vonatkoztatva - előnyösen 38—43% szenet, 7—10% nitrogént és 5—7% hidrogént tartalmaznak. A glükopeptideket a találmány szerint a következőképpen állíthatjuk elő és különíthetjük el: a megfelelő baktérium? ej t akt 5Î tenyészetet képezünk, a tenyésztett bálaériumsejteket elkülönítjük a tenyészettől, adott esetben a baktériumsejteket elroncsoljuk, majd a tenyésztett sejteket vagy azok lizátumait kétfázisú oldószeres extrakciónak vetjük alá. Az utóbbi műveletben a glükopeptidet oldhatatlan maradék formájában kapjuk. A glükopeptidek előállításának kiindulási anyagként bármilyen ismert forrásból származó C parvum baktériumtörzset felhasználhatunk. A kiindulási baktériumsejteket általában a megfelelő baktériummal megfertőzött emlősök vagy szárnyasok szervezetéből, így például vérmérgezésben szenvedő egyedek véréből különíthetjük el. A C. parvumot továbbá egészséges emberek bőréből is izolálhatjuk. Az immunreakciót fokozó sajátságokkal rendelkező C parvum baktériurnsejteket — amelyekből a találmány szerint elkülönítjük a glükopeptideket - egéren kifejtett máj- és lépsülynövelő hatásuk és/vagy egéren kifejtett adjuváns hatásuk [Adlam, C. és M.T. Scott: J. Med. Microbiol, 6, 261 (1973)] alapján, valamint az egéren jelentkező daganatokkal szembeni elienállóképesség alapján [Woodruff, M.F.A. és Boák, J.L.: Brit. J. Cancer 20, 345 (1966)] könnyen azonosíthatjuk. A glükopeptideket bármely ismert módon előállított baktérium-sejttenyészetből elkülöníthetjük. A frissen elkülönített sejteket tenyésztés előtt előnyösen fagyasztva szárított állapotban tá-oljuk. A sejteket megfelelő táptalajban, például j vegyes% glükózzal és 5 téríogat% lószérunimal kiegészített Robertson-fále húsleves-táptalajon (Mackie and McCartney’s Handbook of Bacteriology, ■ 0. kiadás, kiadó: R. Cruickshank, Livingstone. Edinburgh és London, 1960, 233. oldal) tenyésztjük. A tenyészetet néhány napig, általában 5 -7 napig szobahőmérsékletnél magasabb, például körülbelül 37°C-on tartjuk, a táptalajt célszerűen nem mozgatjuk. A tenyésztés hozamának növelése céljából az első tenyészet termékeivel további növesztő közegeket, példáui 1 vegyes% glükózt tartalmazó táptalajokat olthatunk be, amelyekben a növesztést a fentihez hasonló körülmények kozott végezz,ük. Növesztő táptalajként az említett közegen kívül Todd-Hewiít táptalajt (Üsd az idézett Mackie—McCartney kézikönyv i 9 2. oldalát) és tioglükolát-táptalajt (lásd az idézd t Mackie—McCartney kézikönyv 234 oldalát) is felhasználhatunk. Annak érdekében, hogy a maximális sejthozamet a lehető legrövidebb idő alatt érjük el, a sejteket egymás után alteny észetekben tenyésztjük. Az egyes altenyészetekben célszerűen a növekedés logaritmikus fázisában végezzük a tenyésztést. Az oltóanyag előnyösen a következő tenyészet 10 térfogat %-ának megfelelő mennyiség lehet, azonban az utolsó lépésben célszerűen az utolsó tenyészet 2-3 térfogat%-ának megfelelő mennyiségű oltóanyagot használunk A tenyésztett baktériumsejteket ismert módon, például centrifugálással különíthetjük el a táptalajtól Az így kapott baktériurnsejteket az extrakció előtt célszerűen többször mossuk, mosófolyadékként például 0 h ? vegyes ' -os vizes nátriumkioiidoldatot vagy derztiiláit vizet használhatunk. A baktériumsejteket szokásos lizátumképzési műveletekkel roncsolhatjuk. A sejtroncsolást fizikai-kémiai módszerekkel, például az izotóniásnál nagyobb ozmózisnyomású pufferoldat alkalmazásé-5 10 15 20 25 20 3í 40 45 50 55 60 65 2
