173676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükopeptidek előállítására
5 173676 6 val és a viszkózus lizátum egyidejű mechanikus keverésével végezhetjük, azonban mechanikus roncsolási módszereket, például ultrahang-besugárzást, sejten belüli üregképzést, alacsony hőmérsékleten és nagy nyomáson keskeny nyíláson történő átpréselést, például Hughes-prést (lásd az idézett Mackie—McCartney kézikönyv 309. oldalát), vagy homogenizálóban vagy malomban történő mechanikus keverést (lásd az idézett Mackie-McCartney kézikönyv 308. oldalát) is használhatunk. A sejtfal-törmeléket előnyösen például centrifugálással különítjük el a lizátum többi komponenseitől. A iizátumot körülbelül 30—90 percig centrifugálhatjuk 15 000—25 000 g gyorsuláson, így például a cenírifugálást 20 000 g gyorsuláson 1 órán át végezhetjük. Előnyösen úgy járunk el, hogy a Iizátumot első lépésben kis, példáiul körülbelül 300 g értékű gyorsulással 3 percig előcentrifugáljuk, majd az itt kapott felső folyadékfázist visszük át a nagysebességű főcentrifugálási lépésbe. Az előcentrifugálási lépésben a sértetlen sejtek az üledékben maradnak. A sejtfal-törmelékek és/vagy tenyésztett teljes sejtek és/vagy azok lizátumainak kétfázisú oldószeres extrakcióját vizes anlalkoholokkal végezzük. A glükopeptidet a vizes fázisba át nem oldódott sejtanyagokból különítjük el. Az „arilalkohol” megjelölésen olyan hidroxiaromás vegyületeket értünk, amelyben a hidroxil-csoport közvetlenül az aromás maghoz kapcsolódik. Különösen előnyös arilalkohol a fenol [lásd például Westphal, 0. és Jann. K.: Methods in Carbohydrate Chemistry 5, 83 (1966), Ed. Whistler, pub Academic Press, New York és London], továbbá a szubsztituált fenolok, így a krezol. A kétfázisú oldószeres extrakcic során a sejtanyagot G—100°C-on, előnyösen 15-70°C-on kezeljük vízzel és aiílalkohoÜal. Az extrakciót célszerűen keverés közben végezzük. Az extrakció ideje a hőmérséklettől függően néhány perc vagy néhány óra lehet. Ha arilaikohoíként fenolt használunk, az extrakciót célszerűen 68°C on végezzük. Ebben az esetben az elegye! 15 percig keverjük a megadott hőmérsékleten. Az arilalkohol-víz rendszer arilalkohol-tartalma bizonyos mértékig változhat, azonban minden esetben olyan kétfázisú rendszert kell alkalmaznunk, ahol a fázisok egymással kölcsönösen telítettek. A fenol-víz rendszerek 10-90 térfogat % fenolt, előnyösen azonban 40-55 térfogaí% fenolt tartalmazhatnak. Az extrakciós lépés után az elegyet 15—45 percig körülbelül 5 000-10 000 g gyorsuláson, például 30 percig 8 000 g gyorsuláson centrifugáljuk. Ekkor négy fázisból álló rendszert kapunk, ahol az alsó fázis a sejttörmelékekből álló szilárd réteg, amely fölött rendre az alkoholos fázis, egy fehér átmeneti fázis, és a vizes fázis helyezkedik el. Ha az eljárás során sejtroncsolást nem alkalmaztunk, az átmeneti fázis mennyisbe csekély lehet, vagy az átmeneti fázis el is tűnhet. Ebben az esetben a centrifugálás csak három fázist, nevezetesen sértetlen sejtekből álló szilárd fázist, és afölött elhelyezkedő alkoholos, illetve vizes fázist szolgáltat. A vizes és az alkoholos fázisokat elöntjük, majd ezután célszerűen a szilárd anyagot ismét kétfázisú oldószeres extrakciónak vetjük alá. Az extrakciós műveletet előnyösen addig ismételjük, amíg a centrifugálás után színtelen (vagy színes alkohol esetén változatlan színű) alkoholos és vizes fázisokat kapunk. Eljárhatunk úgy is, hogy csak a vizes fázist öntjük el, és az ismételt extrakciós műveletben az alkoholos és a szilárd fázis elegyéből indulunk ki. A vizes fázis - és adott esetben az alkoholos fázis — elöntése után kapott anyagot ezután célszerűen vízzel szemben dializáljuk az arilalkohol, illetve az arilalkohol-maradékok eltávolítása céljából. A dialízist több napon át, előnyösen szobahőmérsékletnél alacsonyabb hőmérsékleten, például körülbelül 4°C-on végezzük. A dialízis után a következő fázisokból álló üledéket kapjuk: sötét színű alsó fázis (ez a fázis nem jelenik meg, ha a centrifugálás után az alkoholos fázist elöntjük), barnás-krémszínű, olajos konzisztenciájű középső fázis, és finom eloszlású szuszpenziós felső fázis. Ezt az utóbbi fázist elválasztjuk, és a szuszpendált szilárd anyagot elkülönítjük. így az immunreakciót fokozó hatású glükopeptidet kapjuk, amelyet célszerűen desztillált vízzel vagy fiziológiás sóoldattal (0,85 vegyes%-os vizes nátriumkJorid-oldat) mosunk. Az igy előállított glükopeptideket daganatokkal és különféle kórokozókkal szembeni ellenállás kifejlesztésére, illetve a o3p,ar<atok és kórokozók növekedésének megakadályozása és/vagy a fertőzöítség csökkentése céljából emlősöknek és szárnyasoknak adhatjuk öe. A glükopeptideket megfelelő terápiás vagy profilaktikus dózisban adagoljuk. A glükopeptidek például a leukémiás tumorok, a Hodgkin-kór, a tüdő-, hólyag- és meilrák, a melanoma és a Burkitt-lymphoma megelőzésére vagy kezelésére, továbbá a Bordetella pertussis és Brucella abortus baktériumok, valamint a protozoás kórokozók, így a malária kórokozója ellem védelem kifejlesztésére alkalmazhatók. A megelőzéshez vagy kezeléshez szükséges giúkopeptid-dózis természetesen a daganat vagy a kórokozók által okozott fertőzés típusától és súiyossagi fokától, továbbá az adott glükopeptid jellegétől és az adagolási módtól függően változik. A glükopeptideket általában 0,1-20 mg/testsúly kg, előnyösen 0,5-10 mg/testsiíly kg, célszerűen 0,7- -2 mgjtertsúly kg dózisban adjuk he a kezelendő emlősöknek vagy szárnyasoknak A glükopeptideket a kezelendő daganat helyétől és jellegétől, valamint a kórokozók által okozott fertőzés jellegétől függően, az orvos által meghatározott módon adagolhatjuk. A hatóanyagokat orálisan vagy pulmonárisan is beadhatjuk, rendszerint azonban szubkután, intramuszkuláris, intraperitoncális, vagy, legcélszerűbben, intravénás injekció formájában adagoljuk. A hatóanyagot kívánt esetben hosszabb időn — például néhány órán — át tartó infúzióval juttathatjuk a szervezetbe. A találmány szerint előállított és elkülönített glükopeptideket ismert módon gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. A készítmények előállítása során például a glükopeptideket egy vágj' több 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
