173662. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ovulációt serkentő új nonapeptidamid-származékok előállítására
31 173662 32 (b) BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02 >Pro-NH-CH2 -CH3 előállítása 670 mg BOC-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02 )-Pro-NHCH2-CH3-t szobahőmérsékleten 20 percen át 10 ml trilfuor-ecetsavval keverünk, majd az oldathoz 50 ml vízmentes étert adunk. A képződött csapadékot vákuumban szemcsés nátrium-hidroxid felett szárítjuk. A kapott port 5 ml dimetil-formamidban feloldjuk, majd az oldathoz 0,11 ml trietil-amint, valamint 243 mg BOC-Trp-OH-ból és 150 mg HONB-ből a DCC-módszerrel előállított BOC-Trp-ONB-t adunk. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük, majd a képződött terméket 50 ml etil-acetát beadagolása útján kicsapjuk. A csapadékot kiszűrjük, majd vízzel mossuk. Tisztítását dimetil-formamid és etil-acetát elegyéből végzett újrakicsapással végezzük. így 220 mg mennyiségben a 190-193 °C olvadáspontú cím szerinti vegyületet kapjuk. Rf4= 0,27. Fajlagos forgatóképesség [ajj^ -42,4° (c = 0,5, dimetil-formamidban). Elemzési eredmények a CSoH73Oi3N13 • H20 képlet alapján: számított: C =55,49%, H =6,98%, N =16,82%, talált: C =55,14%, H=7,16%, N =16,76%. (c) (Pyr)Glu-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2 -CH3 előállítása Az a) lépésben kapott vegyületből 2l5mg-ot feloldunk 50 ml metanolban, majd a kapott oldatot 100 mg palládiumkorom katalizátor jelenlétében 3 órán át hidrogénezzük. A katalizátort ezután kiszűrjük, majd a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot éterrel mossuk és szűrés útján elkülönítjük, amikor is a megfelelő szabad savat kapjuk. 426 mg BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro- NH-CH2-CH3-t 5 ml trifluor-ecetsawal keverünk szobahőmérsékleten 30 percen át 0,1 ml 2-merkapto-etanoI és 0,4 ml n sósavoldat jelenlétben, majd az oldathoz vízmentes étert adunk. A képződött finom fehér csapadékot kiszűrjük, majd szemcsés nátrium-hidroxid felett vákuumban szárítjuk, amikor is a megfelelő szabad bázist kapjuk. Az igy kapott port ezután 0,06 ml N-etü-morfolinnal együtt feloldjuk 2 ml dimetil-formamidban, majd a kapott oldathoz hozzáadjuk a fentiekben ismertetett módon előállított szabad savat és 102 mg HONB-t. A reakcióelegyet ezután 0 °C-ra lehűtjük, majd 110 mg DCC-t adunk hozzá. A kapott oldatot először 0 °C-on 2 órán át, majd szobahőmérsékleten 10 órán át keverjük, ezután szűrjük a képződött diciklohexil-karbamid elkülönítésére és a kapott szűrletet etil-acetáttal hígítjuk. így finom csapadékot kapunk, amelyet kiszűrünk. A nyers védett nonapeptid-etilamidot ezután szilikagélből készült oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, eluálószerként etü-acetát, piridin, ecetsav és víz 60 : 20 : 6 :10 arányú elegyét használva. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat (vékonyrétegkromatográfiásan ellenőrizzük) összeöntjük, majd bepároljuk, amikor is 250 mg csapadékot kapunk. Ezt a csapadékot 5 ml hidrogén-fluoriddal 0,1 ml anizol és 0,1 ml 2-merkaptoetanol jelenlétében 0 °C-on 60 percen át keverjük, majd a hidrogén-fluoridot vákuumban ledesztilláljuk. A maradékot 20 ml vízben feloldjuk, majd a vizes oldatot 1 cm átmérőjű és 10 cm hosszú, Amberlite CG-410 (acetát formájú) gyantával töltött oszlopon átbocsátjuk. Az oszlopot ezután vízzel alaposan mossuk. Az eluátumot és a mosóoldatot egyesítjük, majd 1,2 cm átmérőjű és 30 cm hosszú, karboximetil-cellulózból készült oszlopra felvisszük. Az eluálást gradiens-módszerrel végezzük 300 ml 0,005 mólos és 300 ml 0,15 mólos, 6,8 pH-jú ammónium-acetát-puffert használva. A tiszta pepiid a 160 és 260 ml közötti frakciókban eluálődik, amelyeket egyesítünk és állandó súlyig liofilizálunk. így a cím szerinti vegyületből 100 mg-t kapunk. Rf1 = 0,31, Rf2= 0,76. Fajlagos forgatóképesség [«j|,5= -47,2 (C = 0,25, 5%-os ecetsavoldatban.) Aminosav-elemzés: His = 0,96, Arg =1,01, Trp= 1,89, Glu = 0,92, Ser = 0,96, Pro = 1,11, Alá = 1,00, Leu = 1,02 és Tyr = l,05 (86%os átlagos visszanyerés). 11. példa Gyógyászatiig elfogadható savaddíciós só előállítása 100 mg, az 1. példában ismertetett módon előállított (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2 -CH3 nonapeptidamidot feloldunk 3 ml 0,1 n vizes sósavoldatban, majd a kapott oldatot súlyállandóságig liofilizáljuk, amikor is 98 mg mennyiségben a megfelelő hidrokloridsót kapjuk. Rf2= 0,36. Fajlagos forgatóképesség [a]o2= -48,2° (c = 0,5, vízben). 12. példa Gyógyászati készítmények előállítása a) 2,0 ml fiziológiás konyhasóoldatban feloldunk 20 mikrogramm (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Typ-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2 -CH3 -acetátsót, amikor is injektálható oldatot kapunk. b) 1 ml vízben feloldjuk 25 mikrogramm (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NH■CH2-CH3-acetátsó és 5,0 g mannit keverékét, majd a kapott oldatot ampullába töltjük, liofllizáljuk és végül az ampullát lezárjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
