173548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns influenza-vírustörzs és e törzset tartalmazó vakcina előállítására
9 173548 10 műanyag zsákba helyezzük, és rázógépen (körülbelül 100 fordulat/perc) 37 °C-on inkubáljuk. 4 órás inkubálás után a legyengített alaptörzs növekedésének visszaszorítása érdekében minden üregbe nagymértékben tisztított A(SINGAPORE)57 s (H2N2) vírustörzzsel szemben kialakított hiper - immun nyúlszérumot adunk 1 :3000-es végső hígítás eléréséig, majd folytatjuk az inkubálást. (A hiperimmun nyúlszérumot úgy állítjuk elő, hogy felnőtt nyulaknak 106 hemagglutinációs egységnyi io tisztított teljes vírus/ml (mintegy 20 mg protein/ml)-es injekciót adunk 14 naponként. Ezekből az injekciókból kettőt vagy hármat adunk. A szérumot azután az utolsó injekciót követő három hét múlva gyűjtjük. A hiperimmun szérumot felhasz- 15 nálás előtt normál nátriumklorid-oldattal százszorosára hígítottuk, majd az esetlegesen jelenlevő idegen anyagok elroncsolása céljából külön elővigyázatossági műveletként 2 percig ultraibolya fénnyel sugároztuk be. 37 °C-on végzett összesen 20 48 órás inkubálás után minden egyes üreghez SPF-csirkékből származó vörösvérsejtek 5%-os szuszpenzióját adjuk olyan mennyiségben, hogy a vörösvérsejtek végkoncentrációja 0,5% legyen. A 77 tenyészetből 22 mutat hemagglutinációt. Ezeket a 25 tenyészeteket feltételezett rekombinánsokként elkülönítjük. Minden egyes feltételezett rekombináns 0,1 ml-es mintáját 10 napos SPF tojásokba oltjuk be, majd a tojásokat 3 napon át 37 °C-on inkubáljuk. Ez idő 30 elteltével a tojásokat hemagglutinin jelenlétére vizsgáljuk, és hemagglutinin-gátlási kísérletekkel meghatározzuk a hemagglutinin típusát. Ezen előzetes vizsgálatok alapján négy minta rendelkezik nagy szaporodóképességgel és a virulens A England törzs 35 hemagglutininjével. E minták egyikét később elve- ■ tettük, mert a neuraminidáz-gátló vizsgálatok során kitűnt, hogy ez a rekombináns nem a kívánt virulens A England törzs, hanem az A Okuda alaptörzs neuraminidáz-komponensével rendelkezik. 40 Az igy kiválasztott AOS-tenyészetek fennmaradó mintáit az alapvírusok maradékainak eltávolítása érdekében háromszor klónozzuk. E művelet során azokat a rekombinánsokat is eltávolítjuk, amelyek 45 a fenti kísérletben klinikai szempontból nem bizonyultak megfelelőnek. A vírus-tenyészetet előzetesen ultrahang-kezeléssel (teljesítmény: 80 kilociklus/másodperc) 30 másodpercig roncsoljuk. Ezután klónozás céljából [A. I. Rhodes, C.E. van Rooyen: 50 Textbook of Virology, 3rd. ed. (1958)] a tenyészetet lépésenként kétszeresére vagy háromszorosára hígítjuk, majd a hígított tenyészeteket 10 napos, embriót tartalmazó tojásokba vagy AOS-tenyészetekbe oltjuk be. Minden egyes hígításhoz legalább 8 55 párhuzamos tenyészetet használunk fei. Azokból a tenyészetekből, amelyekben a vírus az alkalmazott hígításban a párhuzamos tenyészetek csak körülbelül 10%-át fertőzi meg, elkülönítjük a határhígítással kapott vírus-részecskét. (A fertőzést az 60 SPF-csirkékből származó vörösvérsejtekkel szemben mutatott pozitív hemagglutináció jelzi.) Minden kiválasztott vírus-részecskét ezután 9—12 napos SPF-tojásokon egy vagy két lépésben tovább tenyésztünk, majd minden kiválasztott rekombináns- 65 ból 10 napos SPF-tojásokban, antibiotikumok használata nélkül steril oltóanyagot készítünk. Ezután az oltóanyagot az antigén-szerkezet meghatározása céljából hemagglutinin- és neuraminidáz-gátlási kísérletekben vizsgáljuk, és — amennyiben megfelelőnek bizonyult — klinikai kísérletekhez használjuk fel. 2. példa A/OKUDA/57(H2N2) - A/FINNLAND/4/74(H3 N2 ) rekombináns törzs előállítása (i) Az alaptörzsek előállítása (a) A legyengített A/OKUDA/57(H2N2) alaptörzs előállítása Az 1. példa (i) (a) pontjában ismertetett, Okuda-törzzsel beoltott allantoisz-folyadék kis mintáját felengedjük, és SPF-tojásokon kétszer klónozzuk. Ezután a mintát normál sóoldattal százszorosára hígítjuk, és ultraibolya fénnyel 30 percig besugározzuk. (b) A virulens A/FINNLAND/4/74(H3N2) alaptörzs előállítása Ezt a törzset a Central Public Health Laboratory (Helsinki, Finnország) intézetben letétbe helyezett torokkenet-mintából tojásokban izoláljuk. A törzs hemagglutinin-faktora 1 :2560. Az előzetesen emberen egyszer tenyésztett vírustörzset SPF-tojásokon egyszer tenyésztjük, majd SPF tojásokon kétszer klónozzuk. A kísérletek céljára egy tojásból származó allantoisz-folyadékot választunk ki, és ezt kis részletekre elosztva —60 °C-on tároljuk. (ii) Rekombináció és a rekombinánsok elkülönítése Az A Okuda alaptörzset 1 :30-as hígításban, AOS tenyészeteken elegyítjük az A Finnland alaptörzzsel. A tenyészteket hemagglutinációs mintatartály üregeibe helyezzük, és a mintatartályt műanyag zsákban, rázógépen 36 °C-on inkubáljuk. 1 óra elteltével a legyengített alaptörzs növekedésének visszaszorítása céljából minden üregbe 1 :2000-es végső hígítás eléréséig antiszérumot adagolunk, majd folytatjuk az inkubálást. Antiszérumként A/OKUDA/57 vírussal szemben kialakított hiperimmun menyétszérumot használunk, amelyet felhasználás előtt 1 :20-as higitásban 2 percig ultraibolya fénnyel sugározunk be. összesen 31 órás inkubálás után a hemagglutinációs aktivitás meghatározása érdekében minden üregbe SPF csirkékből származó vörösvérsejtek 0,5%-os szuszpenzióját fecskendezzük. A 64 tenyészet közül 19 mutatott hemagglutinációt, ezeket külön-külön izoláljuk. A feltételezett rekombinánsok 0,1 ml-es mintáit SPF tojásokba oltjuk be, majd a tojásokat 3 napon át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután hemagglutinin-gátló kísérletekkel meghatározzuk a törzsek hemagglutinin-típusát, majd megvizsgáljuk az AOS-tenyészeteken 5
