173548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns influenza-vírustörzs és e törzset tartalmazó vakcina előállítására
11 173548 12 kifejtett fertőzőképességet és a tojásokban mérhető hemagglutinin-faktort. E vizsgálatok eredményei alapján a 19 elkülönített tenyészet közül 11-et kezelünk tovább. A további kezelés során a mintákat az 1. példa (ü) pontjában ismertetett mód- 5 szenei AOS-tenyészeteken kétszer és SPF tojásokon egyszer klónozzuk. Ezután minden kiválasztott rekombinánsból 10 napos SPF tojásokon steril, antibiotikum-mentes oltóanyagot alakítunk ki, és megvizsgáljuk az oltóanyagok antigén-összetételét. 10 A minták közül 8 rendelkezik az A/FINNLAND/4/74 alaptörzs antigénjeivel, és ezek közül 3 minta növekedési sajátságai hasonlóak az A/OKUDA/57 törzséhez. Ezeket a mintákat választottuk ki a klinikai kísérletek végrehajtásához. 15 Klinikai kísérletek A klinikai kísérletekhez az 1. példa szerint előállított mintákból kiválasztott három, WRL 55, 20 65, illetve 68 jelű rekombinánst, valamint a 2. példa szerint előállított mintákból kiválasztott három, WRL 94, 100, illetve 105 jelű rekombinánst használtuk fel. 25 Az 1. és 2. táblázatban a következő adatok láthatók: a hemagglutinin antigén valamennyi alap- és rekombináns törzsre, a neuraminidáz antigén valamennyi alap- és rekombináns törzsre, és a vírus szaporodóképessége - hemagglutinációs egy- 30 ség/0,25 ml - valamennyi alap- és rekombináns törzsre. A zárójelben levő adatok az egyes alaptörzsek izolálásának évét jelzik. A táblázatok a rekombináns törzsek hemagglutinin (H) és neuraminidáz (N) antigén összetételét is mutatják. 35 A kiválasztott virustörzset tyúktojásokon egyszer tenyésztjük, majd megfelelő koncentrációig hígítjuk. A kapott vírustömeg 1,0 ml-es mintáit ezután intranazálisan adjuk be az önként jelentkező kísér- 40 leti alanyoknak. A beoltást követő 3. és 4. napon a kísérleti alanyok orrváladékából mosással mintát veszünk, és a mintákat embriót tartalmazó 11 napos tyúktojásokba oltjuk be. A tojásokat 2 napig 33 °Con inkubáljuk, majd meghatározzuk 45 a vírus hemagglutininjét. A kísérleti alanyokból a kezelés előtt, valamint a kezelés utáni 14. napon elkülönített vérszérumot ismert módon [lásd például Brit. Med. J. 36, 385 (1968)] hemagglutináció-gátló (HAI) antitestekre vizsgáljuk. 5C Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 3. és 4. táblázat (1, 3 és 5 kísérletek) mutatja, ahol a következő adatok találhatók: a felhasznált rekombináns vírus, a vírus oltóanyag EIDS0 értéke, a kísérleti alanyok száma (ahol szükséges azonos eredményeket mutató csoportokra felosztva) a kezdeti HAI titer a szérumban a kísérleti alanyok reakciói (láz, orrhurut és egyéni kellemetlen közérzet fellépése és időtartama, fokozott zsebkendőhasználat), azon vizsgálati személyek száma, amelyek orrából elkülönített váladékban a beoltást követő 3. vagy 4. napon vírus észlelhető, és azon kísérleti személyek száma, amelyek vérszérumában (a) a HAI-faktor növekedik, illetve (b) a HAI-faktor lényegesen, azaz legalább négyszeresére növekedik. A rekombinációs törzs genetikai stabilitásának meghatározására további genetikai vizsgálatokat végeztünk. Genetikus stabilitáson a rekombináns törzsek kísérleti személyekben mutatkozó legyengülésének időbeli változását értjük. A 4. táblázat olyan adatokat mutat, amelyeket WRL 105 és 100 törzsekkel végeztünk. A rekombinánst előzetesen háromszor klónozott rekombinánssal beoltott egyéni orr váladékból izoláltuk és utána SPF tojásokba juttattuk nagy mennyiségű vakcina készítésének céljából. Az összegyűjtött vakcinát ezután nagy számú önként jelentkező egyénnek adtuk be. A WRL 100/1/74 törzzsel beoltott egyének nagyobb számban reagáltak a vakcinára - az esetek 30%-ában komoly reakció jelentkezett -, mint a WRL 105/1/74 törzzsel beoltott egyének, amiből arra következtettünk, hogy a WRL 105 törzs a gyengítéssel szemben nagyobb genetikai stabilitással rendelkezik, mint a WRL 100 törzs, azaz vakcinaként való felhasználásra alkalmasabb. Az 5. táblázat a WRL 105 törzs intranazális alkalmazásánál mért HAI titer emelkedést mutatja. Az összehasonlításként adagolt placebo nem okozott semmiféle emelkedést a titerben. A WRL 105 rekombináns vírus átvihetőségét vizsgálva, önként jelentkező alanyokba 0,5 ml rekonstruált, fagyasztva-szárított vakcinát adtunk intranazálisan, velük együtt lakó alanyokba pedig kontrollként 0,5 ml placebo-t adtunk. Az eredményeket az 5. táblázat mutatja, amelyből látható, hogy egyetlen placebo-val kezelt egyénnel sem találtunk vírus növekedést vagy ellenanyag termelést, ami szintén mutatja a WRL 105 törzs különös alkalmasságát influenza vakcina készítésére. 1. táblázat Vírustörzs Antigének Szaporodóképesség Hemagglutinin Neuraminidáz hemagglutinin-egység/0,25 ml Alaptörzsek A/OKUDA/57 h2 N2 (1957) 1000 A/ENGLAND/42/72 H, Nj (1972) 96 Rekombináns WRL 55 Hs Nj (1972) 256 törzsek WRL 65 h3 N2 (1972) 512 WRL 68 h3 N2 (1972) 512 6
