173535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-amino-adipoil)-amino-3-metil-3-cefém-4-karbonsav fermentációs úton történő előállítására
19 173535 20 mosás után 300 ml 50%-os vizes aceton-oldattal eluáljuk. Az eluátumot nátriumhidroxiddal semlegesítjük és csökkentett nyomáson betöményítjük. Ehhez a koncentráturnhoz etanolt adunk és az elegyet hidegen állni hagyjuk. Az állás közben keletkező kristályokat szűrés útján elkülönítjük és csökkentett nyomáson vízmentesítjük. Kitermelés 0,670 g kristályos DACPC -nátriumsó. (Tisztaság: >98%). 2. példa Egy 5 literes fermentorba betöltünk 2,5 liter olyan táptalajt, amely 3% glükózt, 3% kukoricakeményítőt, 0,5% élesztőkivonatot, 1% gyapotmaglisztet, 0,5% nyers szójabablisztet, 0,05% magnézium-szulfát-heptahidrátot és 0,5% kálcium-karbonátot tartalmaz. Sterilizálás után a közeget beoltjuk a Streptomyces hygroscopicus U-442 (IFO-13598) törzs tenyészetével és 28 °C-on keverés közben 144 óra hosszat inkubáljuk. Eközben 820 jug/ml DACPC halmozódik fel a táptalajban. Más cefalosporin vegyületek (például CPC és DCPC) is képződnek melléktermékként. 2 liter szűrlet 1. példa szerinti kezelésénél 0,3 g kristályos DACPC-nátriumsót kapunk. 3. példa Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikba betöltünk 500 ml olyan inokulum-tápíalajt, amely 5% glükózt, 1% gyapotmag-lísztet, 0,5% nyers szójabab-lisztet, 0,5% élesztőkivonatot, 0,5% polipeptont és 1% kálcium-karbonátot tartalmaz. Sterilizálás után a közeget beoltjuk egy Cephalosporium sp. ATCC-14553 kultúrából származó spóratömeggel és 28 °C-on 96 óra hosszat inkubáljuk. Egy 50 literes fermentorba beadagolunk 30 liter olyan táptalajt, amely 8% szacharózt, 1% gyapotmag-lisztet, 3% kukoricalekvárt, 0,5% DL-metioniní, 0,15% kálcium-karbonátot és 0,05% szójabab-olajat tartalmaz. A táptalajt szokásos módon sterilizáljuk és lehűlni hagyjuk, majd sterilen beoltjuk a fenti kultúrával és 24°C-on inkubáljuk 168 óra hosszat levegőztetés és keverés közben. Amint a tenyésztést befejeztük, a táptalajt szűréssel elkülönítjük, amikor is 25 liter szűrletet kapunk. Ez a szűrlet 105 p g/ml DACPC-t tartalmaz. A szűrlet tartalmaz még penicillint N-t, CPC-t és DCPC-t is. A szűrlethez penicillinázt (Schwarz-Mann készítmény) teszünk a penicillin N elbontása végett és közvetlenül ezután egy 8 literes Amberlite IRA-900 (acetát-alak)-val töltött oszlopra adagoljuk, hogy azon a DACPC-t megkössük. Az ily módon megkötött DACPC-t 20 liter 0,3 n ammóniumacetáttal eluáljuk és a DACPC-ben gazdag frakciókat összegyűjtjük. Ezt az eluátumot 3 liter aktívszénnel töltött oszlopra visszük és vízzel való mosás után az adszorbeált DACPC-t 6 liter 50%os vizes aceton-oldattal eluáljuk. A DACPC-ben gazdag frakciókat összegyűjtünk, nátrium-hidroxiddal semlegesítjük és betöményítjük, ily módon DACPC-tartalmú koncentrátumot kapunk. Ez az oldat nem csupán DACPC-t, hanem DCPC-t és CPC-t is tartalmaz. E két utóbbi vegyület frakcionált kinyerése céljából az oldatot cellulózzal töltött oszlopra visszük és az oszlopot 70%-os vizes propanollal eluáljuk, ily módon CPC-t, DACPC-t és DCPC-t lapunk ebben a sorrendben. A DACPC-frakciókat összegyűjtjük, betöményítjük és cellulóz-oszlopon újra kromatograf áljuk, végül a DACPC-frakciókat összegyűjtjük. Az ily módon kapott oldatot aktívszénnel töltött oszlopra visszük és vízzel való mosás után 50%-os vizes aceton-oldattal eluáljuk. Az eluátumot nátríumhidroxid-oldattal semlegesítjük, betöményítjük és etanol hozzáadása után lehűlni hagyjuk, amikor is a DACPC-nátriumsó csapadék válik ki. Ezeket a kristályokat szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. Kitermelés 0,520 g kristályos DACPC. 4. példa Egy 50 literes fermentorba betöltünk 30 liter olyan táptalajt, amely 6% szacharózt, 5% glükózt, 3% földimogyoró-lepényt, 3% szójabab-lisztet, 1% DL-metionint, 0,15% kálcium-karbonátot tartalmaz. Sterilizálás után a közeget beoltjuk Cephalosporium acremonium K-186 (IFO 9918) spórákkal és 28 °C-on levegőztetés és keverés közben inkubáljuk (levegőztetési sebesség 30 liter percenként, keverési sebesség 250 ford.) 190 óra hosszat, miközben 1790 g/ml DACPC halmozódik fel a táptalajban. CPC és DCPC is keletkezik melléktermékként. A táptalajnak a 3. példában leírt módon való feldolgozása után 10,5 g kristályos DACPC-nátriumsót kapunk. (Tisztaság: >97,5%) 5. példa Egy 5 literes fermentorba beviszünk 2,5 liter olyan táptalajt, amely 5% szacharózt, 3% nyers szójabab-lisztet, 1% DL-metionint, 0,15% kálcium-karbonátot és 3% metiloleátot tartalmaz. Sterilizálás után beoltjuk Cephalosporium polyaleurum 7-64 (IFO-9920) spórákkal és 24 °C-on keverés közben 192 óra hosszat inkubáljuk, oly módon 560 pg/ml DACPC halmozódik fel a táptalajban. Melléktermékként CPC és DCPC is keletkezik. A 3. példában leírt kezelés után 2 liter térfogatrész táptalaj 0,250 g kristályos DACPC-nátriumsót szolgáltat. 6. példa Egy 5 literes fermentorba betöltünk 2,5 liter olyan táptalajt, amely 8% glükózt, 2% gyapotmag-lisztet, 0,5% DL-metionint és 1% káldum-karbonátot tartalmaz. Sterilizálás után beoltjuk az Emericellopsis microspora K-163 (IFO-9922) törzs spóráival és 28 °C-on keverés közben 144 óra 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
