173457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 18-, 19-, és 20-hidroxi-prosztaglandin-származékok mikrobiológiai előállítására
29 173457 30 „Northern Utilization Research and Development Division of U.S. Department of Agriculture” (NRRL), Peoria, Illinois, USA és „Commonwealth Mycological Institute” (CMI), Kew, Surrey, Nagy-Britannia. Az alkalmazott mikroorganizmusok szaporítását a szokásos módon, előnyösen folyékony közegben, rázással vagy keveréssel végzett konstans szellőztetés és levegő bevezetés mellett végezzük. Az említett gombákhoz tartozó és a Streptomyces organizmusok szaporítására alkalmas tenyésztő közegek jól ismertek, és általában a következő komponensekből állnak: 1. szénfonás, így glükóz, maltóz, szacharóz, keményítő, dextrin és növényi olajok, 2. nitrogénforrás, így ammóniumsók, hús- és fia Hisztek, szárított kukoricalekvár és más nitrogéntartalmú tápanyagok, 3. szervetlen sók, így nátrium-, kálium-, magnézium-szulfátok, foszfátok és kloridok és adott esetben nyomelemek. A fenti anyagok kívánt mennyiségét megfelelő mennyiségű csapvízhez adjuk, és az oldatot a mikroorganizmus-tenyészettel történő beoltás előtt sterilizáljuk. A hidroxilezésre kerülő II általános képletű prosztaglandinokat vagy prosztaglandin-származékokat finom kristály-szuszpenzió alakjában vagy oldószerben, így acetonban, etanolban vagy dimetilformamidban oldva adjuk a tenyészethez. A kiindulási prosztaglandinnak az említett gombák lágy Streptornyces tenyészetével végzett inkubálása alatt a szellőztetést rázással biztosítjuk, és a hőmérsékletet 12-48 órán át 20-40 C°-on tartjuk. A hidroxilezést vékonyrétegkromaíográfia segítségével ellenőrizzük. A hidroxilezett termékeket a fermentiéből ismert eljárásokkal elkülönítjük. A fermentáció befejeződése után a fermentlét szűrjük, a szűrletet kb. 3 pH-értékre megsavanyítjuk, és megfelelő szerves oldószerrel extraháljuk. A savanyításhoz használhatunk szerves vagy ásványi savakat, így foszforsavat, kénsavat, hangyasavat és citromsavat. Az extrakciót 1—5 pH-értéken végezhetjük, előnyösen azonban nem savanyítunk 2 pH-értéknél kisebbre, mivel számos prosztaglandin-származék savra érzékeny. Az extrák dóhoz alkalmas oldószerek a ketonok, észterek és éterek, így metilizobutilketon, etilacetát és dietiléter. Úgy is eljárhatunk, hogy a fermentlét meg savanyítjuk, és szűrés nélkül, közvetlenül extraháljuk. A nyerstermékeket ismert eljárásokkal, így közvetlen kristályosítással vagy oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Ehhez megfelelő adszorbens például a szilikagél. A szilíciumdioxidot általában előkezeljük 1% ecetsavat tartalmazó 20% vízzel, és az oszlopot megfelelő szerves oldószerekkel vagy ezek keverékeivel eluáljuk. Ilyen például a 0,1% ecetsavat tartalmazó etilacetát-heptán (8 : 3 tf./tf.) keverék. Az előállított termékek analízise némelykor nehézségekkel jár. A prosztaglandinok tömegspektrometriás vizsgálata gyakran komplex spektrumokat eredményez, amelyeket nehezen lehet kiértékelni és a terméket azonosítani. Olykor még a molekulacsúcs sem határozható meg. Különösei nehézkes és számos esetben lehetetlen elsősorban ; hidroxilcsoportok számának és helyzetének egyér telmű meghatározása a szokásos analitikai módsze rekkel. Ennek érdekében prosztaglandin-szárma zékok azonosítására új analitikai módszereke dolgoztak ki, amelynek lényege, hogy a reakció képes csoportokat, tehát a karboxil-, oxo- é: hidroxilcsoportokat a következő reakciókkal védő csoportokkal látják el: a) a karboxilcsoportokat diazometánnal metilész ter-csoporttá alakítják, b) a 9-helyzetű oxocsoportokat — ha jeler vannak - 9-metoximino-csőportokká alakítják, é: c) a hidroxilcsoportokat trimetilszilil-csopor tokká alakítják, például N,0-bísz(trimetilszilil)-tri fluoracetamiddal. Például a 9-oxo-l la,19kszi-trihidroxi-proszt-13(t)-énsavat (19-OH—PGE^ metil-9-metoximino -lla,15a,19kszi-tri (trimetil)-szililoxi-proszt -13(t )• -enoáttá alakítjuk vagy a 9a,lla,15a,19kszi-tetrahidroxi-proszta-5(c),l 3(t)-diénsav metil-9a,l 1 a,l 5a, 19kszi-tetra(trimetil)szililoxi-proszta-5(c),l 3(t)-dienoáttá alakítható. Az így átalakított termékeket a továbbiakban védett termékeknek nevezzük, és a találmány szerinti eljárást szemléltető példák során a védett termékre, valamint a szililezett metilészterre vagy a zárójelekben megadott csoportokra történő hivatkozás egyértelműen a fenti csoportokkal védett vegyületet jelenti. A védett terméket gázkromatográfiás kolonnába injektáljuk, amely kétszeresen fókuszáló tömegspektrométerrel van összekapcsolva, és a legnagyobb gázkromatográfiás csúcs spektrumát mérjük. Gázkromatográfiásán választjuk szét a főtermékeket a melléktermékektől, és állapítjuk meg a C-értékeket ezt a definíciót bevezető S. Bergström és társai, J. Biol. Chem. 238, 3555 (1963) módszerével. Ezeknek a C-értékeknek a megállapításához vonatkozó anyagként normál zsírsavak keverékeit használjuk. A vonatkozó anyagok retenciós idejét logaritmikus skálára visszük, és a savak szénatomszámát lineáris skálán tüntetjük fel. Ebből a diagramból az észlelt retenciós idők alapján a C-értékek megállapíthatók. A fenti elvek szerint védett prosztaglandinok gázkromatográfia és tömegspektroszkópia kombinációjával történő vizsgálatára részletes tájékoztatás található a következő közleményekben is: E. Granström, B. Samuelsson, J. Bioi. Chem., 246, 7470 (1971), K. Gréen, Biochemistry, 10, 1072 (1971), K. Svanborg, M. Bygdeman, Eur. J. Biochem. 28, 127 (1972) és F.F.Sun, J.E. Stafford, Bioch. Bioph. Acta 369 , 95 (1974). A C-értékeket a következő gázkromatográfiás körülmények között állapítjuk meg: Kolonna: 1,5 m hosszú, 2,3 mm belső átmérőjű. Álló fázis: 3% OV—17 „Gaschrom Q 100-200 mesh” adszorbensen. Fűtőberendezés hőmérséklete: 235 C*. Vivőgáz: 38 ml Nj/perc. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
