173445. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum elegy előállítására
15 173445 16 Alkotórész Mennyis^ Glicerin 20% laktóz 10% ionmentesített víz 70% Az elkészített szuszpenziókat folyékony nitrogén gőzfázisában tároljuk. Az így készített és tárolt szuszpenziót (1 ml) használtuk fel a vegetatív közeg első fejlődési fokozatának 50 mi-ének az inokulálására, amely közegnek az összetétele azonos volt a fentiekben leírt vegetatív közegével. A vegetatív közeg inokulált első fejlődési fokozatát 22 órán át inkubáltuk 25 C* hőmérsékleten, 250 ml-es szélesszájú Erlenmeyer-tombikban olyan rázógépen, amely 5 cm átmérőjű köríven forgott 250 fordulat/perc sebességgel. A fenti módon készített, 800 ml térfogatú, inkubál t, második fejlődési fokozatú vegetatív közeget használtuk fel 100 liter alábbi összetételű steril termelő közeg inokulálására. Alkotórész Mennyiség Glükóz 25 g/liter keményítő 10 g/liter peptonx 10 g/liter Blackstrap melasz kazein enzimes hidrolizátuma3“ 5 g/liter 4 g/liter magnézium-szulfát (7 H20) 0,5 g/liter Czapek-féle oldat30“ 2,0 g/liter kálcium-karbonát 2,0 g/liter ionmentesített víz ad 1 liter x W. P. No. 159, Inolex Biomedical Corp., Glenwood, 111. 304 N-Z Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y. xxx Czapek-féle oldat összetétele: Alkotórész Mennyiség Vas(II)-szulfát (7 H2 O), (2 ml konc. sósavban oldva) 2 g Kálium-klorid 100 g Magnézium-szulfát (7 H2 O) 100 g ionmentesített víz ad 1 liter A közeg pH-ja autoklávban 30 percen át 121 C’-on 1,1—1,25 at nyomáson végzett sterilizálás után 6,8 volt. Az inokulált termelő közeget 165 literes fermentor tankban fermentáltuk 4 napon át 25 C° hőmérsékleten. A fermentációs közeget steril levegővel levegőztettük 0,5 V/V/M sebességgel, és a szokásos módon kevertük 300 fordulat/perc sebességgel. 2. példa Az A-30912 antibiotikum elegy elválasztása Az 1. példában leírt módon kapott teljes fermentlevet (200 liter) egy órán át kevertük 200 liter metanollal, majd leszűrtük, szűrési segédanyagként diatomaföldet alkalmaztunk (Hyflo Super-cel, Johns-Manville Products Corp.). A szürlet pHját 5 n sósav beadagolásával 4,0-ra állítottuk. A meg savanyított szú'rletet egyenlő térfogat mennyiségű kloroformmal kétszer extraháljuk. A kloroformos extraktumokat egyesítettük, és vákuumban körülbelül 4 liter térfogatra betöményítettük. Ezt a koncentrátumot körülbelül 60 liter dietiléterhez adtuk az A-30912 elegy kicsapása céljából. A csapadékot szűréssel elválasztottuk és szárítottuk, így 38 g A-30912 antibiotikum elegyet kaptunk szürkeszínű por alakjában. A szűrletet vákuumban olajszerű anyaggá töményítettük be, ezt az olajszerű anyagot 500 ml metanolban feloldottuk. A metanolos oldatot 7,5 liter dietiléterhez adtuk, hogy további A—30912 antibiotikum elegy mennyiséget csapjunk le. Ezt a csapadékot szintén szűréssel választottuk el, majd szárítottuk, így további 3,5 g A-30912 antibiotikum elegyet kaptunk. 3. példa Az A—30912 antibiotikum A faktor elkülönítése A 2. példa szerinti módon kapott A-30912 antibiotikum elegy 20 gját acetonitril-víz (95:5) eiegyben szilikagél oszlopra (4 x 107 cm, Woelm) vittük. Az oszlopot acetonitril-víz (95 :5) eleggyel eluáltuk percenként 1—2 ml átfolyási sebességgel, körülbelül 20 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan ellenőriztük szilikagélen, acetonitril-víz (95 : 5) oldószerrendszert és jelző organizmusként Candida albicans-t használva. A 74—125. frakciókat egyesítettük és betöményítettük. A betöményített oldat az állás során kikristályosodott, és további 124 mg szterigmatodsztint szolgáltatott. A 212-273. frakciókat gyesit ettük és vákuumban betöményítettük, így olajszerű anyagot kaptunk. Ezt az olajszerű anyagot kis mennyiségű metanolban feloldottuk. A metanolos oldatot 15 térfogatrész dietiléterhez adtuk. A képződött csapadékot elválasztottuk és megszárítottuk, így 23 mg A-30912 antibiotikum D faktort kaptunk. A 274-437. frakciók A-30912 antibiotikum A, B, C és D faktort 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
