173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
17 173275 18 Ahogy az a táblázat adataiból kiderül, a pH-beállítás után szűrt kukoricalekvárt tartalmazó táptalajon a termelt /3-amiláz mennyisége jelentősen nő. 12. példa A Bacillus cereus var. mycoides tenyésztésével előállított, 572 egység /3-amilázt és 43,5 egység a-1,6-glükozidázt tartalmazó 1 liter enzimoldathoz 10 g oldható keményítőt és 40 g aktív szenet (Norit, Wako Pure Chemicals) adunk, majd keveijük a szuszpenziót, amikor az enzimek adszorbeálódnak az aktív szénen. Szűréssel elkülönítjük az enzimeket. Az elkülönítés után megmérjük a szűrlet és az adszorbeálódott enzimeket tartalmazó aktív szén enzim-aktivitását. Az eredményeket all. táblázatban adjuk meg. 11. táblázat (3-amiláz a— 1,6-glükozidáz A. Adagolt menynyiség 572.000 egység 43 500 egység B. Nem adszorbeálódott menynyiség 197 000 egység 9 700 egység C. Kötött enzim --aktivitás 338 000 egység 33 800 egység A rögzített enzimre számított kitermelés (C/A-B) • 100 90,1 % 100% A táblázat adataiból kiderül, hogy mindkét enzimet kötött alakban különítettük el, a (3-amilázt 90,1 %-os, az a-l,6-glükozidázt gyakorlatilag 100%-os kitermeléssel. Ha nem adunk keményítőt a szuszpenzióhoz, a kötött )3-amilázra számított kitermelés csak 12,4%. 3000 egység kötött /3-amilázt és 310 egység a-l,6-glükozidázt 10 g oldható keményítőhöz adunk, majd vízzel 100 ml-re egészítjük ki a keverék térfogatát. 50 C°-ra melegítjük fel a reakcióelegyet majd ezen a hőmérsékleten, 6—6,5 közötti pH-n reagáltatjuk az enzimet. A reakció lezajlása után meghatározzuk az oldat cukor-összetételét: az oldat 90,5 % maltózt, 7,5 % maltotriózt és 2,0 % oligoszacharidot tartalmaz. 13. példa 100 ml vízhez 50 g kukoricakeményítőt és 10 g Celitet adunk, majd keverjük, és később 30 percen át 60 C° hőmérsékleten tartjuk az elegyet. Az így kapott oldathoz 300 ml, szűrt, 7,1 pH-jú, milliliterenként 403 egység /3-amilázt és 28,0 egység a—1,6-glükozidázt tartalmazó Bacillus cereus var. mycoides tenyészlevet adunk. A két enzim adszorbeálása érdekében keverjük a szuszpenziót. Az enzimek elkülönítésére szüljük a szuszpenziót és megmérjük az aktivitásokat. Az eredményeket a 12. táblázatban adjuk meg. 12. táblázat /3-amiláz a—1,6-glükozidáz A. Eredeti aktivi- 121 000 egység . 8 400 egység tás B. Visszamaradó aktivitás 111 000 egység 1 860 egység C. Kötött enzim-aktivitás 95 300 egység 6 200 egység A rögzített enzimre számított kitermelés (C/A-B)-100 86,7 % 95,1 % Az enzimeket adszorbeált keményítő-Celite keveréket ezután az enzimek eluálására 10 %-os vizes, 10% nátriumkloridot tartalmazó dextrin oldathoz adjuk. A /3-amiláz és az a— 1,6-glükozidáz visszanyerése sorrendben 100 és 85 %-os. 14. példa 100—100 ml. Bacillus cereus var. mycoides tenyészléből nyert, milliliterenként 758 egység (3-amilázt és 37,1 egység a-l,6-glükozidázt tartalmazó szűrletet egyenként 5 g savas agyaggal, bentonittal, talkummal, Celittel és Perlittel keverünk, amikor az a—1,6-glükozidáz adszorbeálódik. Az adszorbeálódott enzimet szűréssel vagy centrifugálással különítjük el, vízzel alaposan mossuk, majd meghatározzuk aktivitását. Az eredményeket a 13. táblázatban adjuk meg. 13. táblázat Adszorbeálódott a—1,6-glükozidáz (egység/g) Adszorbeálódott /3-amiláz (egység/g) Savas agyag 612 790 Bentonit 648 694 Talkum 416 200 Celit 492 0 Perlit 532 0 A táblázat adataiból kiderül, hogy az a-1,6-glükozidáz mindegyik vizsgált adszorbensen jól adszorbeálódik, a kötődés mértéke 400 és 700 egység/g között változik. 15. példa 100 g (száraz súly) elfolyósított keményítőhöz (D. E. 1,5%) 30 000 egység /3-amilázt, 3 000 egység a-l,6-glükozidázt és 0,73% CaCl2-2Ha O-t adunk. 500 ml végtérfogatra hígítjuk a reakcióelegyet, majd 50 C°-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten és 6—6,5 közötti pH-n elvégezzük a reakciót. 100 óra múlva papírkromatográfiásan meghatározzuk az elegy cukorösszetételét. Az elegy 90,6 % maltózt, 7,1 % maltotriózt, 0,0% glükózt és 2,3 % más szacharidot tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
