173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
15 173275 16 K2HP0„ 0,3% MgS04 • 7H20 0,1 % CaCl2 5xlO~4 mól A táptalaj egy részéhez annyi nátriumcitrátot adunk, hogy annak koncentáricója 0,5 % és 1 % 5 legyen. A táptalaj egy másik részét 0,25 % és 0,5 % nátriumtartaráttal egészítjük ki. A táptalajokat 50—50 ml-enként, 200 ml-es Erlenmeyer-lombikokban, a szokásos módon sterilezzük. A steril táptalajokat Bacillus cereus var. mycoides mik- 10 roorganizmussal oltjuk, majd 42 órán át 30 C° hőmérsékleten rázatjuk a tenyészeteket. A tenyésztés befejeződése után centrifugáljuk a tenyészlevet, és meghatározzuk a felülúszó /3-amiláz és a—1,6-glükozidáz-aktivitását. Az eredményeket a 8. 15 táblázatban adjuk meg. 8. táblázat Az adagolt szerves sav Adagolt mennyiség (%) Micélium Optikai sűrűség (660 m/i) /3-amiláz (egység/ml tenyészet) a-1,6-glükozidáz (egység/ml) Na-citrát 0,5 4,9 1035,0 20,7 Na-citrát 1,0 4,8 1080,0 17,1 Na-tartarát 0,25 4,7 1119,0 18,4 Na-tartarát 0,5 4,9 1063,0 16,2 Kontroll (nem ad.) 4,9 588,0 13,0 A táblázat adataiból kiderül, hogy a tenyésztési idő közepén adagolt mangánsó körülbelül 1,7-szeresére növeli a termelt a-1,6-glükozidáz mennyiségét, és ugyanakkor nem gátolja a /3-amiláz ugyanazon időben való szintézisét. Ha a tenyésztést olyan táptalajon végezzük, amely a mangánsót már a tenyésztés kezdetén tartalmazza, úgy a termelt a—1,6-glükozidáz mennyisége a mangánsót nem tartalmazó táptalajon elérhetőhöz képest mintegy kétszeres, ugyanakkor a termelt /3-amiláz milliliterenkénti mennyisége 28,8 egységre csökken. 9. példa A következő összetételű táptalajt készítjük el: Polipepton 2 % A táblázat adataiból világosan kiderül, hogy a szerves sav adagolásakor lényegesen nő a termelt /3-amiláz és a— 1,6-glükozídáz mennyisége. 30 10. példa 10 liter össztérfogatú fermentorokba 5 liter, a következő összetételű táptalajt öntünk: Tejkazein 4 % K0HPO4 0,3% MgSü4-7H20 0.1% CaCl2 5x10~4 mól Oldható keményítő 0.5 % 35 40 mikroorganizmust a termelt a—1,6-glükozidáz mennyisége 2,4-szer több mint repcemag pogácsa nélkül folytatva a tenyésztést. A repcemag-pogácsát tartalmazó táptalajt a sejtek eltávolítására centrifugáljuk. Két liter felülúszót négy liter hideg etanollal egyesítünk, amikor az enzimek kiválnak az oldatból. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. Így poralakú enzimet kapunk, amely grammonként 115 800 egység ß-amiläzt és 4640 egység a-1,6-glükozidázt tartalmaz. A /3-amilázra számított kitermelés 75 %-os, míg az a— 1,6-glükozidázra számítva 70 %-os. 11. példa Az egyik fermen torba a táptalaj térfogatára számítva 4 % repcemag-pogácsát adagolunk. Ezután 30 percen át 121 C° hőmérsékleten sterilezzük a két fermentorban lévő táptalajokat. A steril táptalajokat 100 ml Bacillus cereus var. mycoides tenyészettel oltjuk, majd 30 C° hőmérsékleten, percenként 5 liter levegőt átbuborékoltatva a táptalajon és percenkénti 250-et forduló keverővei keverve folytatjuk a tenyésztést. A tenyésztés 24. órájában centrifugáljuk a tenyészlevet és meghatározzuk a kapott felülúszó enzim-aktivitását. Az eredményeket a 9. táblázatban adjuk meg. _______________________ 9. táblázat Repcemag-pogá- /3-amiláz aktivitás a—1,6-glükozidáz csa (%) (egység/ml te- aktivitás (egység/ml nyészlé) tenyészlé) 4,0 2470,0 106,0 Kontroll (repcemag-pogácsa nélkül) 2600,0 44,4 A táblázat adataiból világosan kiderül, hogy a repcemag-pogácsát tartalmazó táptalajon tenyésztve a 8 %-os kukoricalekvár (4% szárazanyag-tartalom) pH-ját nátriumkarbonáttal 7,5-re állítjuk be. A pH-ál- 45 lítás hatására kivált, egy a /3-amiláz termelését gátló anyagot tartalmazó csapadék eltávolítására centrifugáljuk a szuszpenziót. 200 ml-es térfogatú Erlenmeyer-lombikokba egyenként 50 ml felülúszót öntünk, 0,5 % keményítőt adunk hozzá, majd a 50 szokásos módon eljárva sterilezzük a táptalajt. Bacillus cereus var. mycoides-szel oltjuk a steril táptalajokat, majd 30 C° hőmérsékleten, aerob körülmények között 42 órán át folytatjuk a tenyésztést. A tenyésztés végén a sejtek eltávolítására centrifugáljuk 55 a tenyészlevet, a felülúszó /3-amiláz- és a-1,6-glükozidáz-aktivitását meghatározzuk. Az eredményeket a 10. táblázatban adjuk meg. _________________________________10. táblázat /3-amiláz-aktivitás a—1,6-glükozidáz (egység/ml) (egység/ml) Kontroll 52,1 35,3 A /3-amiláz termeiését gátló anyag eltávolításával 592,7 41,4
