173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
13 173275 14 Mali őzt állítunk elő igen sok szubsztrátot tartalmazó reakcióelegyben, miközben meghatározzuk az optimális reakcióhőmérsékletet és a reakcióelegy optimális pH-értékét. A használt reakcióelegy a 3. táblázatban megadott mennyiségben a megadott összetevőket tartalmazza. 6. példa Oldható keményítő (D.E. 1,5) Foszfát-puffer (pH 6,5-7) vagy acetát-puffer (pH 5—6) CaCl2 ß—amiláz a—1,6-glükozidáz Teljes térfogat 1 g 3. táblázat 0,05 mól 0,01 mól 1016 egység 13,1 egység 10 ml A pH hatásának meghatározására a reakciót 50 C° hőmérsékleten végezzük, a reakcióelegyek pH-ját pedig 5,0-, 5,5-, 6,0-, 6,5- és 7,0-re állítjuk be. Az eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg. 4. táblázat Maltóz egyenérték+ ___________ 10 15 20 Reakcióidő (órákban) pH. 2 8 24 36 48 72 óra 5,0 ±0,1 49 70 73 74 77 76 5,5 ±0,1 55 77 82 82 83 84 6,0 ± 0,1 63 83 92 92 97 100 6,5 ± 0,1 63 79 91 94 96 100 7,0 ±0,1 59 78 89 91 92 96 Maltóz egyenéiték = Redukáló cukor maltózban per szárazanyag x 100. A hőmérsékletnek a reakciójára kifejtett hatását úgy határozzuk meg, hogy az elegy pH-ját 6 és 6,5 közötti értékre állítjuk be, majd a reakciót 40 C°, 50 35 C°, 55 C° és 60 C° hőmérsékleten végezzük. Az eredményeket az 5. táblázatban adjuk meg. 5. táblázat Maltóz egyenérték+_____________ 40 Hőmérsék-Reakcióidő (órákban) letC0 2 8 20 30 48 68 óra 40 64 79 82 87 94 100 50 66 78 85 92 97 100 55 70 78 82 83 87 89 60 68 70 71 72 73 74 7. példa A következő összetételű táptalajt készítjük el: Polipepton 1 % Dextrin 1 % K2HP04 0,3% MgS04'7H20 0,1% Ehhez a táptalajhoz különböző, lxlO-7 és 1x10-3 mól közötti, a 6. táblázatban megadott mennyiségű mangánszulfátot adunk. A táptalajokat 50—50 ml-enként 200 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba öntjük, és a szokásos módon sterilezzük. Sterilezés után Bacillus cereus var. mycoides-szel oltjuk a táptalajokat, és 42 órán át 30 C° hőmérsékleten, levegőztetés mellett folytatjuk a tenyésztést. Ezután centrifugáljuk a tenyészetet, a felülúszó /3-amiláz és o-l,6-glükozidáz-tartalmát meghatározzuk. Az eredményeket a 6. táblázatban adjuk meg. A táblázat adataiból világosan kiderül, hogy a mangánszulfát adagolásával az a— 1,6-glükozidáz termelése közel háromszorosára nőtt. 6. táblázat Az adagolt mangán szulfát mennyisége (mól) 1 Micélium mennyisége (optikai intenzitás 660 m/r) a-1,6-glükozidáz, egység/ml tenyészet /3-amiláz, egység/ml tenyészet 0 6,7 11,3 699 lxlO-7 6,5 14,2 678 1x10-6 5,8 18,6 166 5xl0-6 5,6 23,4 155 lxlO-5 5,9 25,0 132 lxlO“4 5,9 28,3 152 lxlO-3 5,8 25,2 153 8. példa 200 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba egyenként 50 ml, a következő összetételű táptalajt sterilezünk a szokásos módon Polipepton 1 % Dextrin 1 % k2hpo4 0,3% MgS04 •7H20 0,1 % Bacillus cereus var. mycoides mikroorganizmussal oltjuk a táptalajokat, majd 24 órán át 30 C° hőmérsékleten rázatjuk a tenyészetet. Ekkor a táptalaj milliliterenként 237 egység /3-amilázt tartalmaz. Ezután sterilen, a táptalaj térfogatára számítva lxlO-4 mól mangánszulfátot adunk a tenyészethez, majd folytatjuk az inkubálást. A tenyésztés 42. órájában leállítjuk a fermentációt. A sejtek eltávolítására centrifugáljuk a tenyészlevet, a felülúszó /3-amiláz- és a—1,6-glükozidáz-aktivitását meghatározzuk. Az eredményeket a 7. táblázatban adjuk meg. 7. táblázat Tenyésztés Micélium /3-amiláz a-1,6-glükozidáz MnS04 ideje (óra) optikai sűrűség (egység/ml te(egység/ml tényé(600 m/r) ny észlé) szét) 0 42 6,7 377,6 13,0 lxlO-7 mól a 24 6,5 236,8 12,5 tenyésztés 24. órájában adva 42 6,6 244,5 22,5 lxlO-4 mól a tenyésztés kezdetén adva 42 5,2 28,8 25.0 7
