173105. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-nitro-9-dialkil-aminoizoalkilamino-akridinek és sóik előállítására
3 173105 4 80 °C és 120 °C közötti hőmérsékletre melegítjük, majd szobahőmérsékletre hütjük és egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel hígítjuk, ezután káliumkarbonát vizes oldatával meglugosítjuk, és a szabad bázisként kapott (I) általános képletű I-nitro-9-diákilaminoizoalkilamino-akridint egy szerves oldószerrel extraháljuk, majd szárítjuk, adott esetben kristályosítjuk, ezután kívánt esetben bj) ásványi savval alkotott sójává, előnyösen hidrokloriddá, hidrobromiddá vagy szulfáttá vagy szerves savval alkotott sójává, előnyösen laktáttá, szukcináttá vagy dtráttá alakítjuk, vagy b^) hidrogén-klorid dietiléteres oldatával megsavanyítjuk, majd egy szerves oldószerből a dihidroldoridsót átkristályosítjuk. A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek daganatellenes hatását az alábbi kíréletek során tanulmányoztuk: I. In vitro módszerek 1 1. Szövettenyészet (LS-leukocita sejtvonalak) Eagle és Foley [Cancer Research, 18_ 1017 (1958)] által kidolgozott, illetve Smith és munkatár - sai[Cancer Research. 19*843-847 (1959)] által módosított szövettenyészt esi módszerrel végeztük az alábbi kísérleteket emberi eredetű daganatos sejteken, azaz lS-sejtvonalakon Eagle féle táptalajt (amelyhez 1 % borjuszérumot adtunk) hasznává. Kémcsövekbe töltött fenti táptalajt beoltottunk 4 ml 40-80 ezet sejtet tartámazó szuszpenzióval, ami 40-80 pg sejtfehérjének felel meg. A tenyészet növekedését a sejtfehérje szaporulatából Folin Cicaltean-féle reagents, illetve Cyama és Eagle [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 91 305 (1956)] átá kidolgozott módszert alkalmazva fotometriásan határoztuk meg. Miközben a sejtekkel beoltottuk a kémcsöveket, a vizsgált vegyület vizes oldatából 0,2 — 0,2 ml-t adtunk a kémcsövekbe olymódon, hogy a következő koncentrációkat kaptuk: 100, 10, 1, 0, 1, 0,1 és 0,001 pg/ml táptalaj. A kémcsövek inkubáása 37 °C-on történt. 72 óra múlva meghatároztuk a sejtfehérje szaporodását azokban a kémcsövekben, amelyekbe a vizsgát vegyületet adagoltuk, váamint a kontrollként hasznát kémcsövekben is. Minden koncentrá ciót két kísérletben egymássá párhuzamosan vizsgátunk. Meghatároztuk az anyagnak azt a koncentrációját is, amelynek révén a sejtfehérje növekedésének 50 %-os gátlását sikerült elérni. Ez az úgynevezett LDS0- E százáékos gátlást az áábbi összefüggés alapján számoltuk: a kontroliban mért végső LS-sejt kon-Gátlás % = 100 centrációa kontroliban mért végső LS-sejt koncentráció-végső LS-sejt koncentráció a kísérletben - a kontroliban mért kezdeti LS-sejt koncentráció Az áltáában elfogadott normák [Leiter, J. és Abbet, B.J.: Cancer Research.25., (3/2), 522 (1965)] szerint azok a vegyületek tekinthetők hatásosaknak, meiyekná az LD50 kisebb vagy egyenlő 1 ü/ml értékkel. Leiter és munkatársai szerint az üyen vegyületeket klinikai vizsgáatnak kell áávetni attól függetlenül, hogy az in vivo kísérletek szerint milyen eredményeket adnak. A fenti csoporthoz tartozó vegyületeket a fenti módszerrel többször, is megvizsgátuk. Az LDS0 0,001 /rg/ml értéknek felel meg. meg. 2. Miyamura-féle módszer (Ehrlich-féle ráksejtek) A módszer azon alapul, hogy Ehrlich-féle ráksejtek [5.106 sejt/ml] dehidrogenáz-aktivitásának gátlását a vizsgát vegyületek segítségével meghatározzuk, ahol a meghatározás mértéke a nem redukát redoxfesték (reszazurin) zónájának átmérője, amelyet 37 °C-on történő 5 órás inkubáció után kapunk a vizsgát vegyület 1 %-os oldatát tartámazó henger körül. Az átáában elfogadott kritériumok szerint az anyag akkor tekinthető hatásosnak, ha a gátlási zóna legalább 20 mm. A táámány szerint előálított vegyületek különösen erős daganatellenes hatást mutatnak ebben a kísérletben, hiszen egyes vegyületeknél ez a zóna 28-30 mm. 3. Zsályamagok csírázásgátlása (növekedési kísérlet) 80 mm átmérőjű Petri-csészékbe lehetőség szerint egyenletesen elhelyezünk 20-25 zsáyamagot két réteg szűrőpapírra. Ezt követően a Petri-csészékbe öntünk 30 ml, a vizsgáandó vegyületet 1 mg/ml koncentrációban tartámazó oldatot a kontroll csészékbe pedig desztillát vizet öntünk. Az edényeket 24 órán át inkubájuk 20-30 °C-on, majd lemérjük a keletkezett csírák hosszát. A gátló hatást a csíráik átlagos hosszának a kontrolihoz viszonyított százáékos csökkenéséből határozzuk meg. A zsáyamagok csírázásáná a gátlás százáékos értéke 86-88 % a táámány szerint előálított vegyületek esetében. IL In vitro módszerek Crocker-féle egérszarkóma-(Sa-180) növekedésgátlása. A kísérlet elvégzéséhez körülbelül háromhónapos korú és 25 g-os súlyú egereket hasznátunk. Ezeket beoltottuk az Sa-180 szarkóma egy metszetével, majd csoportokra osztottuk az egereket. Az első csoport, a kontroll csoport 10 egérből áll, míg a 24 kezelt csoport egyenként 7 egérből ál. A mejpelel ő dózisokban vizsgát vegyületeket intraperitoneáisan adagoljuk, előzőleg megálapítva a maximálisan elviselhető dózist. A vegyületek daganatellenes hatásának elbíráásához elfogadtuk azt a kritériumot, mely szerint megállapítjuk a kontroll egerek daganatainak átlagsúlya és a kísérleti vegyületekkel kezelt egerek daganatának átlagsúlya közötti százáékos különbséget, figyelembe véve a toxikus hatásokat. Azokat a vegyületeket fogadtuk el hatásosnak, amelyek legáább kétszer gátolták 40 %-ná nagyobb mértékben a daganatok növekedését, viszont nem idézték elő az egerek elpusztulását (kettőnél több egér nem pusztát el) és az egerek átlagsúlya nem csökkent 4 g-ná többel. Az egyes vegyületeket többször is megvizsgáltuk in vivo. így a C-829 kódszámú 1 -nitro-9-(2-dimetilamino-1 -metil - etil-amino)-akridin dihidrokloridot 33- szor vizsgátuk különböző dózisokban, és azt találtuk, hogy a Crocker-szarkoma (Sa-180) növekedését a dózistól függően optimális mértékben gátolta: 0,05- 0,2 mg/kg dóásná a gátlás 17-73%. Farmakológiai vizsgáataink ugyanakkor azt mutatták, hogy az akridin származékai közül a C-829 kódszámú vegyületnek viszonylag legáacsonyabb a toxidtása. Intravénás beadássá egereken, illetve patkányokon mát LDS0 értéke átlagban 21 mg/testsáykg, illetve 13 mg/testsáykg. Ugyanakkor az orális beadás esetén mérhető LDS0 értékek mintegy 100 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 V. 60 65 2
