172939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás madárinfluenza elleni inaktivált vakcina előállítására
5 172939 6 A gyöngytyúkok és kacsák között Közép-Európában általában a 3. és 4. szerotípus a legelteijedtebb. Magyarországon előfordul még a 2. és 6. szerotípus is. Ezért a bivalens inaktivált vakcinát gyöngytyúkoknak és kacsáknak, a 2. szerotípus bevonásával készült trivalens vakcinát pedig gyöngytyúkoknak javasoljuk. A kapott vakcinát elsősorban tojó állatok egyszeri, fertőzésmentes állomány védelme esetében kétszeri beoltására használjuk tojásrakás előtt 2—4 héttel. Fertőződési veszély és fertőzöttség esetén növendék állatoknak is adhatjuk a vakcin '.t. Tojóállományokban alkalmazva egyrészt a tojásrakás miatt fokozottan igénybe vett és potenciálisan veszélyeztetett tqjóállatok védelmét érhetjük el, másrészt a tojásszikben megjelenő ellenanyagok szikimmunitása révén védelmet nyújtanak a kikelő állatoknak. A szikimmunitás az anyától származó és a tojásban is benne levő vírus teijedése elé is gátat vet. A nehezen felismerhető módon veszélyeztetett vagy fertőzött állományok vakcinázása termelési biztonságot jelent. Ugyanis a klinikai megbetegedés legjellemzőbb tünete a tojástermelés kisebb-nagyobb, gyakran egészen jelentős csökkenése, amely ha nem is vezet az állomány kényszervágására, súlyos termeléskiesést okoz. A termelés biztonságát a vakcinázás azáltal biztosíthatja, hogy az immunitás birtokában az egyes állatfajokban levő genetikai képesség veszély nélkül kiaknázható. Ez utóbbit immunizálás hiányában az influenza fellépésének kockázata miatt nem lehet megtenni. Ezért a tenyésztők rendszerint 50% tápból és 50% kukoricadarából álló takarmánykeveréket adnak a termelés visszafogására. A vakcina az oltás utáni 3. hétre már mérhető ellenanyagszintet hoz létre, amely néhány hétig — megfelelő időben történő oltás esetén éppen a tojástermelés miatt legveszélyesebb időszakban — magas szintű, azután fokozatosan csökken a mérhetőség határa alá. Kisfokú védettség azonban egy tojásrakási szezonban és elsősorban a lerakott tojás szikjében még várható, függetlenül attól, hogy a vérben — adott vizsgálati módszereink mellett — az oltás utáni 2-6 hónap között az ellenanyagszint már alacsony vagy nem mérhető. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa A vírusantigén termeléséhez 10 napig előkeltetett, embriónált tyúktojásokat használunk. A tojások allantois üregébe oltással bejuttatunk 0,2 ml hígított vírusszuszpenziót. A hígított vírusszuszpenzió a madárinfluenza 00125 MNG számon letétbe helyezett 3-4. szerotípusú átmeneti vírustörzsének élettani konyhasóoldattal készített 10'1 * * 4 vagy 10"5 arányú hígítása. A tojások fertőzésére használt hígított vírusszuszpenzió sterilitási vizsgálatát az alábbi módon végezzük. A vírusszuszpenzióból pipettával 0,2—0,5 ml-t viszünk fel közönséges agarra, húslevesbe és Tarozzi-féle májlevesbe és 24, 48, 96 illetve 120 óra után bírálunk. Penészgomba kimutatására vihetünk a vírusszuszpenzióból söragarra is, amikor 1 hét múlva bírálunk. Az embrió amnion-allantois folyadékának (aaf.) vírustartalmát inaktiválása előtt, 10 napos SPF (specific patogen free, meghatározott kórokozóktól mentes) embrionált tojásokon történő titrálással (embrió infektív titer, EID) és/vagy az aaf. hemagglutináló (HA) titerének Takátsy-féle plexilapon történő meghatározásával állapíthatjuk meg. A beoltott tojásokat 72 órán át 37 C°-on inkubáljuk, és naponta kétszer lámpázzuk. Az 1. napon elhullott embriókat kiselejtezzük, a 2. naptól az embriókat tartalmazó tojásokat +4 C° hőmérsékletű hűtőben gyűjtjük, majd az elhullott vagy elhalóban levő embriókról az amnion-allantois folyadékot leszívjuk és összekeverjük. Ilyenkor minden keverésből ugyancsak elvégezzük a fent ismertetett sterilitási próbát. Ezután meghatározzuk a vírustartalmú, egységesített amnion-allantois folyadék vírus titerét és ártalmatlanságát. Á vírus titer meghatározása a fent ismertetett módon történik. Az ártalmatlanságot úgy állapítjuk meg, hogy a tömény aaf. 0,1—0,2 nú-ével 10-15 db 10 napos embrionált SPF tojást és 20 db 14-28 napos gyöngycsirkét vagy kacsapipét oltunk. Ártalmatlanság esetén sem az embrionált tojások, sem a növendék állatok közül nincs nagyobb kiesés, mint az oltatlan kontrolloknál. Ezután a virustartalmú amnion-allantois folyadékot a folyadékmennyiségre számított 1% mennyiségű 10%-os vizes formaldehid-oldat hozzáadásával és 2 órán át tartó termosztálással inaktiváljuk, majd +4C° hőmérsékletű szekrényben tároljuk. Ezután pHját 0,1 n sósavoldattal 6,5-re állítjuk be, majd a folyadék 200 ml-éhez 50 ml 2%-os AIPO4 gélt adunk. A folyadékot 2 órán át állni hagyjuk, közben időnként rázzuk. A kapott vakcinát a felhasználásig 0 C° és +4 C° közötti hőmérsékleten tároljuk. Az oltóanyag lejárati ideje ilyen tárolás mellett 1 év. 2. példa A vírustartalmú amnion-allantois folyadék előállítását, valamint vírus titerének és ártalmatlanságának vizsgálatát az 1. példa szerinti módon végezzük. A kapott folyadékhoz a térfogatra számítva 0,5% mennyiségű, 1 :2000 hígítású vizes 0-propilakton oldatot adunk. A folyadékot állni hagyjuk 2 órán át, majd pHját 0,1 n sósavval 7-re állítjuk be. Az inaktivált vírust tartalmazó folyadék 200 ml-éhez 50 ml 2%-os Al(OH)3 gélt adunk. A folyadékot 2 órán át állni hagyjuk, közben időnként rázzuk. Az 1. példa szerinti vakcinához hasonló stabilitású oltóanyagot kapunk, amelyet 0 C° és +4 C° közötti hőmérsékleten tárolunk. 3. példa Az 1. példa szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy 00142 MNG számon deponált 1. szerotipusú madárinfluenza törzsből indulunk ki. A megfelelő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
