172931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására
Il 172931 12 Küvetta jelzése 1 2 3 foszfát-puffer, 0,25 mól, pH 5,2 2,80 2,70 2,68 SMBTH, 0,1 mól 0,05 0,05 0,05 pirokatechin 0,5 mól 0,10 0,10 0,10 aszkorbát-oldat, 20 mmól-0,1 0,1 aszkorbátoxidáz 500 E/ml-0,02 25 C° hőmérsékleten 1 percig inkubálunk, Et értékét leolvassuk, majd reagens hozzáadásával indítunk a következő difenoloxidáz 200 E/ml 0,05 0,05 0,05 17 percig 25 C° hőmérsékleten inkubálunk, E2 értékét leolvassuk, E2—Ej-ből meghatározzuk AE-t A E 0,890 0,485 0,896 Az 1-es jelű küvetta a zavartalan mérésnek felel meg. A 2-es jelű küvettában 2/zmól aszkorbát az elméleti értéket 47%-kal csökkenti, ezt a hibát a 3-as jelű küvettával kapott eredmény szerint 10 E aszkorbátoxidáz teljesen kiküszöböli. 8. példa Tesztpapír glükóz kimutatására vizeletben Szűrőpapírt a következő összetételű oldattal itatunk át, majd szárítunk 50 C° hőmérsékleten: 1,2 mólos citrát-puffer, pH 5 50,0 ml 9-('y-dimetil-amino-propil)-6-klór-3-amino-karbazol-dihidroklorid 0,75 g glükózoxidáz (104 E/mg) 0,25 g peroxidáz (63 E/mg) 0,05 g aszkorbátoxidáz (100 E/mg) 1,00 g víz 100,0 ml A tesztpapfr glükóz-tartalmú vizeletekkel vöröses-narancstól feketés-vörösig terjedő színárnyalatokat ad. 2 perces reakcióidő után azonos glükóz-tartalmú, 150mg/dl-ig terjedő aszkorbinsav-tartalmú vizeletekkel azonos reakciószíneket érünk el. Azonos összetételű, de aszkorbátoxidázt nem tartalmazó tesztpapíroknál ezzel szemben a glükóz-tartalomtól függően a reakciószínek 50mg/dl aszkorbinsav-koncentrációtól kezdődően gyengébbek vagy meg sem jelennek. 9. példa Tesztpapír vérnek kimutatására vizeletben Szűrőpapírt egymás után impregnálunk a következő oldatokkal, majd a szűrőpapírt megszáritjuk. 1- es oldat 1,2 mólos citrát-puffer, pH 5,25 35,0 ml etilén-diamin-tetraecetsavasdinátriumsó 0,1 g dioktil-nátrium-szulfoszukcinát 0,5 g 2,5-dimetilhexán-2,5--dihidroperoxid (kb. 70%-os) 1,6 g foszforsav-trimorfolid 12,7 g aszkorbátoxidáz (100 E/mg) 0,3 g metanol 30,0 ml víz 100,0 ml-re feltöltve 2- es oldat 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin 0,3 g fenantridin 0,2 g toluol/petroléter (30 : 70) 100,0 ml-re feltöltve Ezzel a tesztpapírral vizeletben 5 eritrocita/mm3 jelenléte 30—50 mg aszkorbinsav/100 ml jelenlétében is kimutatható. Azonos összetételű, de aszkorbátoxidázt nem tartalmazó tesztpapírral ez a kimutatás már 10-20 mg aszkorbinsav/100 ml jelenlétében nem sikerül. 10. példa Tesztpapír A Tesztpapír, mint a 9. példában ismertetett, de aszkorbátoxidáz nélkül. Tesztpapír B Karboximetilcellulózból (területsúly 60g/ma) készített vízoldékony papírt 20%-os metanollal készített jégecet-oldatba mártunk semlegesítés céljára, majd megszárítjuk. Ezután aszkorbátoxidáz vizes oldatával (103 E/ml) bepermetezzük és rögtön megszárítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
