172931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására
9 172931 10 25 C° hőmérsékleten 3 percig inkubálunk, Ej értékét leolvassuk, majd indítunk a következő reagens hozzáadásával HK/G6P-DH-oldat, egyenként 56 E/ml 0,05 0,05 0,05 15 percig inkubálunk, E2 értékét leolvassuk, E2—Ei-bői meghatározzuk AE-t AE 0,234 0,307 0,230 Az 1-es jelű küvetta a zavartalan mérésnek felel meg, A 2-es kü vet tavai kapott érték azt mutatja, hogy 0,01 Mmól aszkorbát a vizsgálati eredményt 34%-kal növeli, a 3-as jelű küvettával kapott érték azt igazolja, hogy i E aszkorbátoxidáz teljesen kiküszöböli az aszkorbát által okozott hibát. 5. példa Glutamát meghatározása G1DH, NAD/INT/diaforáz segítségével fotométerben. A mérés hullámhossza 492 nm, a hőmérséklet 25 C°. INT-oldat, 2 mg/ml 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 15 percig 25 C° hőmérsékleten inkubálunk, E2 5 értékét leolvassuk, E2-E1-ből meghatározzuk AE-t AE 0,184 1,560 0,380 0,186 0,182 Az 1-es jelű küvetta a zavartalan mérésnek felel meg. 10 A 2-es és 3-as jelű küvettával kapott érték azt mutatja, hogy 0,5, illetve 0,05 pmól aszkorbát a vizsgálati eredményt 700, illetve 100%-kal növeli. A 4-es és 5-ös jelű küvettával kapott érték azt igazolja, hogy 2 E aszkorbátoxidáz teljesen kikü- 15 szöböli az aszkorbát által okozott hibát. 6. példa 20 Tirozin meghatározása 3-metil-6-káliumszulfonil-benztiazolon-hidrazon-(2)-vel (SMBTH) és tirozinázzal fotométeíben, hullámhossz 492 nm, a mérés hőmérséklete 25 C°. 25 --------------------------------------------------------------------------------Küvetta jelzése 12 3 Küvetta jelzése 1 2 3 4 5 foszfát-puffer, pH 5,6, 0,01 mmól 1,30 1,20 1,29 1,18 1,27 glutamát-oldat, 0,2 mg/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 aszkorbát-oldat, 5 mmól — 0,1 0,01 0,1 0,01 aszkorbátoxidáz, 100 E/ml 0,02 0,02 25 C° hőmérsékleten 3 percig inkubálunk, majd az egyes küvettákba pipettázzuk a következőket foszfát-puffer, pH 5,2,0,25 mól 30 SMBTH 0,1 mól 2,77 2,77 2,77 aszkorbinsav-oldat, 10 mmól — 0,1 0,1 35 víz 0,12 0,02 aszkorbátoxidáz, 500 E/ml — 0,02 40 tirozináz, 60 E/ml 0,05 0,05 0,05 25 C° hőmérsékleten 1 percig inkubálunk, Ei értékét leolvassuk, majd indítunk a következő reagens hozzáadásával tirozin, 2 mmól 0,05 0,05 0,05 0,2 mól TRA, 0,05 mól káliumfosziát-puffer, jÎH 8,6, 1,5% Triton-X-100-a! 1,0 1.0 f fi 1,0 1,0 NAD-oídat, 5 mg/ml 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 dkforáz-oldat, 10 E/ml 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 G1DH 1000 E/mi 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 1 órán át 25 C° hőmérsékleten inkubálunk, E2 értékét leolvassuk, E2-E,-ből megh . irozzuk AE-t AE 1,113 U,728 1,100 Az 1-es jelű küvetta zavart űan mérésnek felel meg, a 2-es jelű küvettával kapott érték azt 55 mutatja, hogy 1 //mól aszkorbát az elméleti értéket 35%-kal csökkenti, a 3-as jelű küvettával kapott érték azt igazolja, hogy 10 E aszkorbátoxidáz teljesen kiküszöböli az aszkorbát által okozott libát. 60 7. példa 50 Ex értékét leolvassuk, a reakciót indítjuk a Pirokatechin meghatározása SMBTH-val és difekövetkező reagens hozzáadásával 65 noloxidázzal 5
