172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
21 172778 22 6. példa Unkái gátlása A következő kísérleti anyagösszetételt alkalmaz- $ tűk: 96 mmól borát-puffer pH = 9,5 114—7,6 mól húgysav 29 mU urikáz/ml 10 0,5 mól KSCN 0,02 xanthin A kísérleti eredményeket a 7. táblázat mutatja. 15 glicerin meghatározása a következő kapcsolt reakciók alapján történik: glicerokin áz EC 2.7.1.30 glicerin + ATP---------------------------------* —* glicerin-3-foszfát + ADP piruvátkináz EC 2.7.1.40 ADP + foszfoenolpiruvát--------------------------------» —► ATP + piruvát . laktát-dehidrogenáz piruvát + NADH + tC--------------------------» EC 1.1.1.27 ■> laktát + NAD 7. példa Ureáz gátlása Az ureáz tiokarbamiddal kompetitiv gátolható a karbamidot illetően. Ez a karbamid kinetikus meghatározására hasznosítható. Ennek során a következő reakciók mennek végbe: karbamid + H20 JUSÍ^C02+ 2 NH3 2a-ketoglutarát + 2 NADH + 2 NH4 + + glutamát-dehidrogenázv V "" ........... 2 L-glutamát + 2 NAD+ + a H2 O A meghatározást kinetikusán a következő reagensekkel végezzük: 20 „A” reagens: 45—55 mmól/liter foszfát suffer, pH = 7,0 4,6—3,1 mmól/liter magntziumszulfát 300-400 mmól/liter nátriumdodecilszulfát 25 2,3-3,5 mól/liter ATP 280—420 mól/liter foszfoenolpiruvát 120-230 mól/liter NADH, 7.7 x 104 U/liter vagy ennél több lipáz 5.8 x 102 U/liter vagy ennél több észteráz 30 9,6 x 102 U/liter vagy ennél több piruvátkináz 5,3 x 10* U/liter vagy ennél több laktátdehidrogenáz „B” reagens: 35 2,9 x 10* U/liter vagy ennél több glicerokináz A meghatározást a következő reagenssel végezzük: 100-200 mmól/liter trietanolamin-puffer, pH = 8,0 14—18 mmól/liter a-ketoglutarát 1,3-1,4 mmól/liter ATS* 440-460 mmól/liter /3-NADH 1—5 x 10”1 m/liter tiokarbamid > 1 x 10* U/liter ureáz > 2 x 104 U/liter glutamát-dehidrogenáz A meghatározás elvégzéséhez a vizsgálandó szérum-minta 5/iliteijét összekeverjük 100 /(liter fiziológiás konyhasó-oldattal és 600 /aliter reagenssel, majd 1-2 perc után leolvassuk és további 2 perc múlva újból leolvassuk a mérési eredményt. A reakciót elemző automatában, így például a Centrifugai Fast Analyser-ban hajtjuk végre 365 nm-en és 25—35 C°-on végezve a mérést. A reakciót Centrifugal Fast Analyser-en végezzük, 340 nm-en és 25 C°-on. A kompetitiv gátlásra alkalmazott ATP-koncentrációjának növelésével a 40 piruvátkináz Michaelis-állandóját látszólag annyira növeljük, hogy az a glicerinnek a vizsgálatban való felső határához képest nagy. A többi enzimet feleslegben adagoljuk. Ezáltal a piruvátkináz-reakció lesz a sebességmeghatározó és a glicerin koncent- 45 rációja meghatározható a reakciósebességből. A vizsgálat elvégzéséhez a vizsgálandó szérummintából 10 /(litert keverünk össze 30-50/(liter fiziológiás konyhasó-oldattal és 500-600 ml „A” reagenssel, majd a reakciókeveréket 10 percig állni 30 hagyjuk. Ezután hozzáadjuk a glicerokinázt és 50 másodperc múlva elvégezzük az első, majd 150—200 másodperc múlva a második leolvasást. A módszerrel literenként 540-8550 mg trigliceridet határozhatunk meg. 55 Regressziós összehasonlítás y = 0,99 x + 0,51 korrelációs koefficiens r = 0,999. 8. példa 60 Triglicerid meghatározása piruvátkináz alkalmazásával. A trigliceridek lipáz/észteráz enzimhatására glicerinre és zsírsavra bomlanak. A szabaddá váló 65 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás valamely szubsztrátum, különösen vérszérumban vagy vérplazmában oldott vagy szuszpendált szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására, amelynek során egy vagy több specifikus enzimet adunk a szubsztrá-11
