172644. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
11 172644 12 3. példa (6R,7R)-3-hidroximetil-7-(tien-2-il-acetamido)-cef-3-em-4-lcarbonsav előállítása 210 g 97,7%os tisztasági fokú (6R,7R)-3-aceto ximetil-7 -(tien-2-il-acetamido)-cef-3-em-4-karbonsav-nátriumsó [Cephalosporins and Penicillins, szerk.: E.Flynn, kiadó: Academic Press (1972)] 2 liter ionmentes vízzel készített oldatát steril azbesztszűrőn bocsátjuk át. Az így kapott, steril oldatot 4 liter, előzetesen egy 10 literes lombikban 30 percig 1400 kg/m2 nyomáson sterilizált, 0,5 mólos foszfátpufferhez (pH - 6,0) adjuk. Ezt az elegyet 2 liter Rhodotorula rubra CBS 6469 tenyészettel oltjuk be (a mikroorganizmust 3 napon át 25 C°-on, forgó rázógépen, 1 vegyes % (6R,7R)-3- -acetoximetil-7 -(tien-2-il-acetamido)-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmazó táptalajon tenyésztettük). A tenyészetet 3 liter/perc sebességgel levegőztetjük, és mágneses keverővei keverjük. Az elegyet szobahőmérsékleten (25 C°-on) 4,0 és 6,0 közötti pH-értéken tartjuk. Az elegyből időről időre mintát veszünk, és a mintát vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnak vetjük alá. A kapott kromatogramokat ismert mennyiségű (6R,7R)-3-acetoximetíl-7-(tien-2- -il-acetamido)-cef-3-em4-karbonsavat és (6R,7R)-3- -hidroximetil-7-(tien-2-il-acetamido)-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmazó oldatok vékonyrétegkromatogramjával hasonlítjuk össze. A hidrolízis 67 óra elteltével válik teljessé. Ekkor a 6630 ml térfogatú elegy milliliterenként körülbelül 25 000 pg végterméket tartalmaz. A kiindulási anyag és a végtermék meghatározását előnyösen a következőképpen végezzük: Előre bevont cellulóz-lemezeket (MN300, Camlab Cambridge) 0,1 mólos acetát-pufferoldatba (pH = 5,0) merítünk, és a lemezeket lassan megszárítjuk. 8 térfogatrész etilacetát, 1 térfogatrész n-butanol és 8 térfogatrész acetát-pufferoldat elegyét 2 órán át rázzuk, majd a szerves fázist elválasztjuk, és ezt az oldatot alkalmazzuk futtatószerként. A lemez alapvonalára 1 pl megfelelően hígított mintát és 1 pl 5000 pg/liter koncentrációjú összehasonlító oldatot cseppentünk. A lemezeket 45 percig futtatjuk, majd megszáritjuk, és 10 percig ultraibolya fénnyel (Xmax. 253 nm) megvilágítjuk. Az elkülönített cef-3-em-4-karbonsav-származékok mennyisei meghatározását denzitometriás úton végezzük. Tekintettel arra, hogy a végtermékben a 7-es helyzethez nem-poláros tienilacetamido-csoport kapcsolódik, ez a vegyület oldószeres extrakcióval különíthető el. Az extrakciót például a következőképpen végezzük: A 6630 ml térfogatú fermentléhez az élesztő elpusztítása céljából 130 ml formaiint adunk. Az elegyet állni hagyjuk, majd a felső folyadékfázist dekantálással elválasztjuk, és 1000 ml-es részletekben extraháljuk. Az extrakciót a következőképpen végezzük: az oldatot pH = 2,2—2,5 értékre savanyítjuk, és 2 liter butilacetáttal elegyítjük. A vizes fázist 200 ml butilacetáttal extraháljuk. A butilacetátos frakciókat egyesítjük, és a kapott 2000 ml térfogatú oldatba ipari minőségű metanollal készített 12,5%os káliumacetát-oldatot csepegtetünk mindaddig, amíg további csapadék már nem válik ki. A terméket leszűrjük és acetonnal mossuk. Az extrakció hatásossága 70%. A végtermék káliumsóját igen tiszta állapotban kapjuk. A káliumsó 194-198 C°-on olvad bomlás közben, ez az érték megegyezik a hiteles minta bomláspontjával. (1 121 308 sz. brit szabadalmi leírás.) 4. példa (6R,7R)-3-Hidro ximetil-7-(tien-2-il-acetamido)-cef-3-em-4-karbonsav előállítása (a) 1 kg, az 1. példában leírt módon előállított és fagyasztással tartósított Rhodotorula rubra CBS 6469 szuszpenziót 10 liter vízzel elegyítünk, és a szuszpenzióhoz keverés közben 500 g (6R,7R)-3-acetoximetil-7-(tien-2-il-acetamido)-cef-3- -em-4-karbonsav-nátriumsót, [Cephalosporins and Penicillins szerk.: E.Flynn, kiadó: Academic Press (1972)] 250 g kálium-dihidrogénfoszfátot és 28,5 g dinátrium-hidrogénfoszfátot adunk. Az elegyet, amelynek pH-értéke 5,8, erélyesen keverjük, és nagy sebességgel levegőztetjük. A reakció menetét vékonyrétegkromatográfiás úton követjük. Adszorbensként szilikagélt, eluálószerként 0,5 mólos nátriumklorid-oldatot használunk, és a foltokat ultraibolya fényben tesszük láthatóvá. 34 óra elteltével a kiindulási anyag teljes mértékben átalakul. Az élesztőt centrifugálással elkülönítjük és félretesszük, és a felső folyadékfázist kovasavgélen keresztül szűrjük. A szűrletet gyors ütemben 10%-os ortofoszforsav-oldattal, keverés közben, szobahőmérsékleten pH = 2,1 értékre savanyítjuk. A kivált szilárd anyagot a lehető leggyorsabb ütemben leszűrjük, és desztillált vízzel savmentesre mossuk. A kapott ( 6 R ,7 R ) -3-hidroximetil-7 -(tien-2-il-acetamido)-cef-3- -em-4-karbonsavat vákuumban 40C°-on szárítjuk. 364 g (86%) terméket kapunk. A termék metanollal és 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal tiszta oldatot képez, forgatóképessége :(a)D= +135° (c = 1%, metanolban). A termék ultraibolya, infravörös és NMR-spektruma megegyezik a hiteles mintáéval. (1 121 308. sz. brit szabadalmi leírás.) (b) A Rhodotorula rubra CBS 6469 mikroorganizmus újrafelhasználása. Az (a) lépésben elkülönített Rhodotorula rubra CBS 6469 mikroorganizmust 10 liter vízben szuszpendáljuk, és a szuszpenzióhoz 500 g (6R,7R)-3- -acetoximet il-7-(tien-2-i]-acetamido)-cef-3-em-4-karbonsav-nátriumsót, 250 g kálium-dihidrogénfoszfátot és 28,5 g dinátrium-hidrogénfoszfátot adunk. Az elegyet az (a) lépésben megadott módon levegőztetjük és keverjük. A reakció vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint 22 óra alatt ér -véget. Ekkor 5 10 IS 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
