172644. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
9 172644 10 borostyánkősavat, adonitet, D-mannitot, D-szorbitot, illetve szalicilt tartalmazó táptalajon 1, 2, illetve 3 hét elteltével növekedés észlelhető. L-szorbóz esetén a látens növekedés 2 hét, míg L-ramnóz esetén a látens növekedés 1 hét elteltével indul meg. A mikroorganizmus egyetlen szénforrásként laktózt, melibiózt, oldható keményítőt, inulint, tej savat, eritritet, dulcitot, a-metil-glükozidot, illetve inozitot tartalmazó táptalajokon a fentivel azonos körülmények között nem növekedik. Egyetlen nitrogénforrásként ammóniumszulfátot vagy etilamin-hidrokloridot tartalmazó táptalajon 1, 2, és 3 hét elteltével növekedés észlelhető, nitrát-asszimiláció azonban nem lép fel. A mikroorganizmus a zsír-hidrolizálási és keményítő-termelési kísérletben negatív, az arbutin-hasítási kísérletben pozitív reakciót ad. 60%-os ozmózisnyomású közegben nem növekedik, vitaminmentes folyékony közegben csak 16 nap elteltével indul igen gyenge növekedésnek. A törzs 100 milliomodrész aktidiont tartalmazó folyékony közegben növekedik. A mikroorganizmus növekedése során nem deríti a krétát tartalmazó Gorodkova-táptalajt, azaz nem termel savat. Az 1-10. példában mikroorganizmusként a fenti sajátságokkal rendelkező Rhodotorula rubra CBS 6469 törzset használtunk fel. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-karboxi-pentánamido)--3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsav előállítása 500 g, körülbelül 70%-os tisztasági fokú ( 6 R ,7 R)-3-acetoximetil-7 -(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-cef-3-em-4-karbonsav-káliumsó [Cephalosporins and Penicillins, szerk: E. Flynn, kiadó: Academic Press (1972)] vizes’oldatát steril azbeszt - -lemezen bocsátjuk át, és az így kapott sterilizált oldatot egy 10 literes lombikban levő 2 liter steril foszfátpuffer-oldathoz (400 mmól, pH = 6) töltjük. Az elegyhez körülbelül 2 liter, 3 napon át 1 vegyes % cefalosporin C-t tartalmazó táptalajon tenyésztett Rhodotorula rubra-szuszpenziót (CBS 6469) adunk. A körülbelül 8 liter végtérfogatú elegyet mágneses keverővei keverjük, és steril levegővel 2 liter/perc sebességgel levegőztetjük. Az elegyet 60 napig szobahőmérsékleten keverjük. Ekkor a kromatográfiás vizsgálat szerint a kiindulási anyag több, mint 90%-a (6R,7R)-7-(D-5- -amino-5-karboxi-pentánamido)-3-hidroximetil-cef-3- -em-4-karbonsawá alakult. Az elegyet centrifugáljuk, majd a folyadékfázis pH-ját 4,5 értékre .állítjuk be, és a folyadékfázist aktív szénnel töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot az ágytérfogat négyszeresének megfelelő mennyiségű, hideg ionmentes vízzel mossuk, majd az oszloptérfogat négyszeresének megfelelő mennyiségű 40%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot acetát-formájú Amberlite IRA-68 anioncserélő gyantára visszük fel. A gyantaoszlopot az oszloptérfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű, hideg ionmentes vízzel mossuk, majd 0,1 mólos káliumacetát-oldattal eluáljuk. Az eluátumhoz 5,75 térfogatrész acetont adunk, a kivált csapadékot leszűrjük, és levegőn 35 C°-on szárítjuk. 68%-os hozammal 68%-os tisztasági fokú (6R,7R)-7-(D-5-amino-5-karboxi-pentána mido)-3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsavat kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak a hiteles mintáéval. [Biochem. Journ. 81, 591 (1961)]. 2. példa 3-Hidroximetil-7j3-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-cef-3-em-4-karbonsav előállítása 3-Acetoximet il-7/3-(D-5-a mino-5 -karbo xi-pent ánamido)-cef-3-em-4-karbonsavat [Cephalosporins and Penicillins szerk.: E.Flynn, kiadó: Academic Press (1972)] tartalmazó fermentlevet aszeptikus körülmények között elkülönítünk. 4 liter teljes fermentlevet előzetesen sterilizált 5 literes fermentorba töltünk. A fermentlé pH-ját 5n foszforsavval, 5,0-ra állítjuk, majd 800 fordulat/perc sebességgel keverjük, és steril levegővel 3 liter/perc sebességgel levegőztetjük. A termelő Cephalosporium mikroorganizmus autolízisének megakadályozása érdekében az elegybe 7,0 ml/óra sebességgel 50 vegyes %-os glükóz-oldatot vezetünk. Az elegy pH-ját időnkénti 5 n foszforsav-oldat beadagolásával 5,0 és 5,5 közötti értéken tartjuk. 2,2% keményítőcukrot 0,25% nitrogént (kukoncalekvár formájában), 0,5% kálium-dihidrogéntoszfátot és 0,1% 1:1 arányú polipropilénglikol - fehér ásványolaj elegyet tartalmazó vizes közeget sterilizálunk, m közeg pH-ját sterilizálás előtt 5,8 értékre állítjuk be. Sterilizálás után a közeghez 0,1 vegyes % mennyiségű cefalosporin C-káliumsót adunk oldat formájában. Az így előkészített táptalajon 36 órán át 25 C°-on Rhodotorula rubra CBS 6469 mikroorganizmust tenyésztünk. 400 ml így kapott közeget használunk fel az előző fermentlé beoltásához. A vegyes tenyészetből időről időre elemzés céljából mintát veszünk. A mintát 15 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, majd a felső folyadékfázist vékonyrétegkromatográfiásan elemezzük. 12 óra elteltével a minta folyadékfázisában 3-acetoximetil-7/3-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-cef-3-em-4-karbonsav (cefalosporin C) már nem mutatható ki, azonban egy új termék, a 3-hidroximetil-7/3-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-cef-3-em-4-karbonsav (dezacetil-cefalosporin C) jelenik meg. E vegyületet a fermentlé 6,2 mg/ml koncentrációban tartalmazza. 4 liter vegyes tenyészetet pH,= 4,5 értékre savanyítunk, majd szűrési segédanyagon szűrünk. A szűrletet az 1. példában leírt módon dolgozzuk fel. A terméket 35 C°-on levegőn szárítjuk. 17,1 g 76,8%-os tisztasági fokú 3-hidroximetil-7/3-(D-5-amino-5-karbo xi-pentánamidoVceM-enHl-kaibonsavat kapunk. [Biochem. J. 81, 591 (1961)] 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
