172633. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusellenes tiazolinil- vagy 5,6-dihidro-4H-1,3-tiazinil benzimidazolészterek előállítására
17 172633 18 típusú influenza-vírusok szaporodását is gátolják, beleértve az Ann Arbor, Maryland B, Massachusetts B, Hong Kong A, Pr-8a és Taylor C (A, B típus) influenza törzseket. Az 1 általános képlet körébe tartozó vegyületek különböző vírusok szaporodását megszüntető képessége in vitro könnyen bizonyítható folt-megszüntetéses teszt alkalmazásával, melyet Siminoff [Applied Microbiology: 9/1, 66-72 (1961)] ír le. Ezt a specifikus tesztet az alábbiakban részletesen megadjuk. Az I általános képletű vegyületeket a következő módszerrel teszteljük. Tesztmódszer 25 ml-es Falcon lombikokban afrikai kabócamajom-vesesejteket (BSC-1) vagy Hela sejteket 37 C° hőmérsékleten tenyésztünk 199 táptalajban 5% inaktivált főtális marhaszérummal (FBS), penicillinnel (150 egység/1 ml) és szteptomicinnel (150 pg/ml). Ha összefüggő réteg képződik, akkor a felső táptalajt eltávolítjuk, és mindegyik lombikhoz 0,3 ml megfelelő hígítású vírust (echo-, Meningo-, Coxsackie-, polio- vagy rhino-virus) adunk. Szobahőmérsékleten, 1 óra hosszat tartó felszívódás után, a vírussal fertőzött sejtlemezt az alábbi összetételű táptalajjal lefedjük; 1 rész 1%-os Ionager No. 2 és 1 rész kétszeres erősségű 199 táptalaj FBS-el, penicillinnel és sztreptomicinnel, mely 100, 50, 25, 12, 6, 3, 1,5 és 0,75/ig/ml koncentrációban gyógyszert tartalmaz. A gyógyszert nem tartalmazó lombik a teszt kontrollja. A tiazolinil- vagy tiazinil-benzimidazol-észter-vegyületek törzsoldatait dimetil-szulfoxidban, 104 pg/ml koncentrációban készítjük el. A lombikokat polio-, 5 Coxsackie-, echo- és Meningo-vírusra 72 óra hosszat 37 C° hőmérsékleten, és rhinovírusra 120 (ka hosszat 32 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Az influenza-vírus törzseket, mint amilyen az Ann Arbor, Maryland B, Massachusetts B, Hong 10 Kong A, Pr-8a vagy Taylor C (A, B típus), 72 óra hosszat 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk Madin-Darby kutya-vesesejt (MDCK) alkalmazásával. A folt azon a felületen látszik, ahol a vírus fertőz és a sejtben szaporodik. Mindegyik lombikhoz 15 10%-os formalin és 2%-os nátrium-acetát-oldatot adunk, hogy a vírust inaktiváljuk, és a sejtlemezt a lombik falához rögzítsük. A vírusfoltokat, a nagyságuktól függetlenül, a sejtfelület kristályibolyával való bepermetezése után megszámoljuk. A 20 folt-számokat mindegyik gyógyszerkoncentrációnál összehasonlítjuk a kontroll számával. A tesztvegyület aktivitását a százalékos folt-csökkentéssel, vagy a százalékos gátlással fejezzük ki. Az aktivitás mérésére más módon, azaz'IS0-el jelzett gyógyszer- 25 koncetráció alkalmazható, mely a foltképződést 50%rban gátolja. A teszteredményeket poliovirus tip. I gátlásával fejezzük ki, mivel a vírus könnyen szaporodik, és megbízható teszteredményeket ad. Ettől függetle- 30 nül, az előnyös vegyületek aktivitását más víruskultűrákkal szemben is bebizonyítottuk, mint 1. Táblázat 1-Tiazolinil- vagy l-(5,6-dihidro-4H-l ,3-tiazinil)-2-amino-5(6)-alkoxikarbonil-benzimidazolok poliovirus I. foltcsökkenése Gyógyszerkoncentráció jug/ml Példaszám Izomer* 100 50 25 12 6 3 U 0,75 6. 6 100 100 100 100 100 83 45 18 1. 5 100 97 74 44 0 0 0 0 1. 6 100 100 100 100 99 55 16 0 5. 5 100 99 81 49 18 0 0 0 5. 6 100 100 100 100 98 66 31 0 3. 5(6) tox*** tox 100 100 100 100 87 34 2. 5(6) 100 100 100 100 100 100 70 51 4. 5(6) tox tox tox 100 100 100 100 76 8. 5(6) 100 100 100 100 100 100 100 98 7. 6 gy tox** gy tox 100 100 100 100 100 98 9. 6 gy tox 100 100 100 100 100 97 58 10. 6 gy tox gy tox 100 100 100 100 100 100 13. 5(6) gy tox 100 100 100 99 77 34 13 14. 6 tox tox tox m tox**** 77 52 31 40 * az 5 vagy 6 szám az illető izomert jelenti, 5(6) izomerkeveréket jelent, ♦+ gy tox = gyengén toxikus ♦++ tox = toxikus ++++ m tox = mérsékelten toxikus 9
