172619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes analizishez
3 172619 4 időigénye 10 percnél kevesebb és az összes csatorna eredményét egyidejűleg kell leolvasni. Ezért a hordozóhoz kötött enzimek fajlagos aktivitásának igen magasnak kell lennie, hogy a reaktor kicsi lehessen és az áthordást alacsony szinten tarthassuk. A gyakorlatban gyakran nehézséget jelent, hogy egyrészt a reaktorban elég magas hordozóhoz kötött enzim-aktivitást biztosítsanak, másrészt lehetővé tegyék a megkívánt magas minta gyakoriságot. Az enzimaktivitás egyenes arányban nő a reakcióoldattal érintkező anyag felületével. Másrészről azonban nagy felületen - amelyet ráadásul enzimatikusan aktív hordozóanyag esetében mikropórusös és szivacsszerű formában kell előállítani — a szubsztrátumból és termékeiből több abszorbeálódik, mint kis felületen. Ez azt jelenti, hogy egy következő minta eredményeinek az áthordás miatti pontatlansága fokozódik. Ebből következik, hogy nagy felületek esetében a minta közötti kimosást intenzívebbé kell tenni, azaz meg kell hosszabbítani, ami csak a próbagyakoriság terhére valósítható meg. Az enzimreaktornak az analizátor elé való beállításának további hátránya, hogy néhány enzim rögzíthető ugyan, de katalitikus hatását még sem tudja kifejteni, mivel a szubsztrátummal nem jön létre közvetlen érintkezés. Ez olyan szubsztrátumokra érvényes, mint a trigliceridek, amelyek lipofil mikrofázisban vannak, míg a hasításukhoz szükséges lipázok a hordozón hidrofil környezetben helyezkednek el. Ilyen módon nagyon megnehezül, vagy éppen lehetetlenné válik az enzim és a szubsztrátum közötti érintkezés. A találmány alapját képező feladat a fent említett nehézségek elhárítása és az analitikai eljárásoknál, különösen automatikus analizátorok eljárásainál az enzimfelhasználás csökkentése, a meghatározandó anyag átalakításához oldott állapotú enzim használatával. A találmány egyik célja különösen az, hogy a szükséges enzimmennyiséget egy sor ismételt elemzés számára használhatóvá tegyük, anélkül, hogy az enzimeket ehhez rögzítenénk. Ezt a feladatot a találmány szerint enzimes elemzési eljárással oldjuk meg úgy, hogy a meghatározandó anyagot enzimmel átalakítjuk és mérjük — főleg automata-analizátorban — a főreakció vagy a hozzákapcsolt mellékreakció valamely reakciópartnere mennyiségének növekedését vagy csökkenését, az eljárás során az átalakításhoz szükséges enzimet és adott esetben segédenzimeket, valamint segédanyagokat, mint puffert, sókat, koenzimeket, színképző anyagot és hasonlókat tartalmazó oldathoz hozzáadjuk a meghatározandó anyagot tartalmazó mintaoldatát és mérjük az egyik reakciópartner mennyiségét. Az enzimoldatot körfolyamatban vezetjük és a mérés után reaktorba vezetjük, amely a megmért reakcióterméket teljesen eltávolítja az oldatból vagy nem zavaró termékké alakítja át, és az ezután kapott enzimoldathoz — adott esetben az elhasznált alkotórészek pótlása után — újra mintaoldatot adunk. A találmány szerinti eljárásnál tehát az enzimeket, amelyek közvetlenül résztvesznek a reakciókban, nem rögzítjük azaz nem kötjük hordozóhoz, hanem körfolyamatot létesítünk, amelyben a reagensek és az enzimek oldott állapotban vannak és az új mintával való elegyítés előtt, a már elvégzett mérés után eltávolítjuk a következő mérést zavaró vagy meghamisító reakciótermékeket. Az eljárást előnyösen automata-analizátoroknál alkalmazzuk. Az eljárás lehetővé teszi, hogy a hozzá szükséges reaktort az eljárás menetének olyan helyén iktassuk be, ahol már nem befolyásolhatja károsan a minták differenciálását, vagyis a minta és a mérőhely (analizátor, általában küvetta) közötti úton kívül. Ezért a reaktornak sem az alakja, sem a felülete nem befolyásolhatja a minták gyakoriságát és elkerüljük az áthordást. A találmány szerinti eljárás dializátort tartalmazó és nem tartalmazó automata-analizátorokhoz egyaránt alkalmazható. Előnyösen dialízissel egybekötött eljárásoknál használjuk, ahol a zavaró reakciótermékek eltávolítása a primer körön kívül a szekunder körben is bekövetkezhet és ehhez célszerűen különféle reaktorokat alkalmazunk. így a találmány előnyben részesített kiviteli alakja szerint a mérendő reakcióterméket a méréshez részben kidializáljuk a keringő oldatból és a termék dializálatlanul maradt részét nem zavaró termékké alakítjuk át vagy eltávolítjuk. A találmány keretében „reaktor” alatt a reakció-körfolyamat azon szakaszát értjük, ahol a következő mérést zavaró vagy meghamisító minden reakciótermék eltávolítása megtörténik. Ez mind kémiai, mind fizikai úton végrehajtható. A fizikai elválasztás alkalmas adszorbenseken adszorpcióval, vagy fotolízissel történhet, a kémiai átalakítás pedig alkalmas anyagokhoz való kémiai kötéssel, vagy már nem zavaró termékké való kémiai átalakítással. A reaktor kiválasztásánál mindenekelőtt arra kell ügyelni, hogy a körfolyamatban áramló enzimek jelentősebb mértékben ne adszorbeálódjanak. Ez az adszorpció például a reaktornak oldott fehérjékkel, mint albuminnal való előzetes telítése útján akadályozható meg. Az indulási fázis alatti kezdeti adszorpció azonban megengedhető, ha bizonyos idő múlva megszűnik. Lényeges továbbá, hogy a zavaró reakciótermékeket mennyiségileg eltávolítsuk vagy átalakítsuk. Ebből a célból a reaktorban egyes szervetlen vagy szerves anyagokat, vagy ezek keverékét alkalmazhatjuk. A találmány keretében előnyben részesítjük az adszorbeáló anyagokat vagy a hordozóhoz kötött enzimeket, amelyek katalizálni képesek a nem kívánatos reakciótermékek nem zavaró termékekké való átalakítását A reaktorban használt anyag oldhatósága lehetőleg kicsi legyen, nehogy a körfolyamatban szennyezéseket adjon le. A reaktorban használt adszorbensnek vagy reagensnek továbbá olyan természetűnek kell lennie, hogy az eljárás folyamán megtartsa folyási tulajdonságait. Az ilyen feltételeknek megfelelő anyagokat a szakember nehézség nélkül ki tudja választani. A reaktorban a zavaró reakciótermékeken kívül az analízis végrehajtásához szükséges egyéb anyagok is adszorbeáltathatók vagy átalakíthatók. Feltétel azonban, hogy a keringő oldat elhasznált reagensei könnyen pótolhatók legyenek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
