172619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes analizishez
5 172619 6 A találmány szerinti eljárás keretében reaktortöltetként adszorbenseket, mint például aktív szenet, szilikagélt, derítőföldet, kovaföldet, aktivált alumínium-oxidot és aktivált bauxitot használunk, különösen festékanyagok eltávolításához. A találmány szerint használt reaktor előnyösen egy vagy több rögzített enzimet, különösen a hordozóhoz kovalens^ kötéssel kötött enzimeket tartalmaz, amelyek a megmért reakciótermék további átalakítására képesek. A hordozóhoz kötött enzimek ezen találmány szerinti alkalmazásánál áthordási problémák nem lépnek fel, így az enzimreaktor méretezése tekintetében gyakorlatilag nincs korlátozás. A találmány ezen kiviteli alakjára jellemző példa a hordozóhoz kötött dehidrogenázok, mint laktát-dehidrogénáz (LDH) használata olyan reakcióknál, melyek NADH (redukált nikotin:amid-adenin-dinukleotid) képződése közben folynak le és az utóbbi képződött mennyiségét határozzuk meg. Redukálható anyagok, mint piruvát jelenlétében a NADH ismét NAD-dá (nikotin-amid-adenin-dinukleotid) alakul át és így a következő körfolyamatban redukcióra ismét rendelkezésre áll. Ez a kiviteli alak nagyon sok különféle szubsztrát számára alkalmas, amelyek NADH-val vagy NADPH-val (redukált nikotin-amid-adenin-dinukleotid-foszfát) ultraibolya-próbában mérhetők, például glükóz meghatározására. Az eljárás célszerű módosítása - különösen hordozóhoz kötött enzimet használva a reaktorban - abból áll, hogy az oldatot szakaszosan vezetjük vissza a körfolyamatba folyamatos visszavezetés helyett. Szakaszos visszavezetésnél az oldatot mérés után külön frakciókban gyűjtjük össze és mindegyik frakciót a reaktorban külön-külön addig kezeljük, amíg a zavaró terméket teljesen eltávolítjuk. Ez a kiviteli forma különösen akkor előnyös, amikor a hordozóhoz kötött enzim aktivitása viszonylag kicsi és ezért folyamatos visszavezetés esetén a reaktorban hosszú kezelési időre lenne szükség. Szakaszos visszavezetésnél több párhuzamosan alkalmazott reaktorral a reaktor mérete kicsi lehet, anélkül, hogy a kezelési idő megrövidülne. lene. Elvégzett kísérletek azt mutatták, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazott oldott enzimek többszörösen újrahasználhatok és az enzimek újrahasználhatóságának csak a bomlástermékek fo$ kozatos felszaporodása és az oldatnak a hozzáadott minták okozta növekvő hígulása szab határt. A reaktorban hordozóhoz kötött enzimek alkalmazása mellett a találmány szerinti eljárás to- 10 vábbi előnyei közé tartozik, hogy enzimatikusan aktív granulátumot használhatunk az előállításában alapvetően problematikus csőreaktor helyett, a granulátumok elegyítése útján több enzimet alkalmazhatunk és ezzel az egyidejű rögzítést a velejáró 15 problémákkal együtt kiiktathatjuk, és a rendszerbe való bevezetési műveletet úgy alakíthatjuk, hogy ne használódjék el reagens, mivel a körfolyamatba csak reagenseket vezetünk be, de próbát nem. Ezen kívül a találmány szerinti reaktorok, ha rög- 20 zített enzimeket tartalmaznak, a kötött enzimek stabilitására nézve a legkedvezőbb hőmérsékleten működtethetők. A minta fehérjementesítése szükségtelen. Az a gyakran alkalmazott módszer is alkalmazható, hogy az egyes mintákat légbuboré- 25 kokkal választjuk el egymástól. [L. R. Snyder és H. J. Adler, Anal. Chem. 48 (1976) 1017]. A következő példák a találmány közelebbi megvilágítására szolgálnak. Megjegyezzük, hogy a pél- 30 dákban ismertetett vizsgálatok során alkalmazott enzimeket és reagenseket saját laboratóriumunkban állítottuk elő, a detergens kivételével, mely a Klinke cég, Hamburg terméke. 35 I. példa Koleszterin-meghatározás 40 A meghatározást szokványos automata-analizátorban, légbuborékokkal elkülönített mintákon végezzük. 45 a) hagyományos módszer A találmány egy másik alkalmazási lehetősége például olyan reakciók esetében adódik, amelyek valamilyen oxidáz részvételével és így hidrogén-peroxid képződésével mennek végbe. A hidrogén- 50 -peroxidot többnyire színreakcióval mutatjuk ki. Ez a színreakció létrejöhet az enzim-körfolyamatban, amikor a képződött színt mérés után újra eltávolítjuk, például a festék faszénreaktorban való adszorpciója útján. Az is lehetséges, hogy a hidrogén- 55 -peroxid egy részét dializáljuk és csak a dializáh mennyiséget mérjük, míg a körfolyamatban maradt mennyiséget hordozóhoz kötött enzimmel, például hordozóhoz kötött katalázzal elbontjuk. 60 A találmány szerinti eljárás szokványos automata-analizátorokkal, mint például az AutoAnalyzerR -készülékekkel, de más gyártmányokkal is végrehajtható, anélkül, hogy a készültekben meghatározott analízis-paramét er eken változtatni kel- 65 [Clinical Chemistry, 20. kötet, 4. szám. 470—475.0., (1974)]. Az eljárás a következő reakcióegyenletek szerint folyik le: Koleszterin-észter koleszterin-észteráz koleszterin + zsírsav Koleszterin + 02 koleszterin-oxidáz koleszteron + ■f Hj O2 * HjOj + fenol + 4-amino-antipirin (I képlet)£Q£ kinoidális festék (II képlet) (POD = peroxidáz). Az eljárás az alább megadott koncentrációjú, illetve aktivitású oldattal hajtjuk végre: 0,4 M kálium-foszfát puffer, pH = 7,2, 4 térfogat% metanol, 0,4% POD, 0,6 mg 4-amino-antipirin/ml >0,1 E/ml köles zterin-oxidáz, >0,1 E/ml koleszterin-eszteráz, >2JS E/ml peroxidáz, 1,2 ml/ml fenol. 3
