172600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható kivonatok előállítására Mycobacteriumokból és ezek immunológiai adjuvásként való alkalmazása
7 172600 8 a lipidek meghatározását teljes hidrolízis és éteres extrakció után szilikagél vékonyréteg-kromatográfiával végezzük. A fenti módon tisztított Poly-PA a következő tulajdonságokkal jellemezhető: megjelenés: laza fehér por, összetétel: a) aminosavak (mólarány): alanin (3), glutaminsav (2), alfa.alfa’-diaminopimelinsav (2), b) aminocukrok (mólarány): N-acetil-glukózamin (2), N-glikolil-muraminsav (2), N-acetil-galaktózamin van jelen, c) redukáló nem-amino-cukrok: arabinóz, galaktóz, mannóz van jelen, d) lipidek: 0,5%-nál kisebb, az aminosavak koncentrációja 6,2%, az aminocukroké 7—8%, és a maradékot redukáló nem-amino-cukrok alkotják, molekulasúly (a molekulánként! 3 alanin-maradék alapján számolva): 14000 ± 2000, ülepedési állandó: 2, IV-spektrum: 1. ábra. 2. példa 20 g baktérium-tömeget (amelyet a Mycobacterium tuberculosis var. hominis H37Ra törzséből — letétbehelyezési száma ATCC 25177 - állítottunk elő) 36 órán át 28 C°-on kevertetünk 250 cm3 (3 :2 térfogatarányű) piridin-ecetsavanhidrid elegybA. Ezután 2500 cm3 etanolt adagolunk, majd éjszakán át folytatjuk a kevertetést. Az oldhatatlan részt centrifugálással elkülönítjük (4000 ford/perc). A felülúszó réteget vákuumban szárazra pároljuk, és a maradékot 200 cm3 vízben felvesszük. A vízoldhatatlan hányadot centrifugálással (4000 ford ./perc) elkülönítjük. A felülúszó réteget Biogel P10 oszlopon szűrjük át. Liofilizálás után 100 mg vízoldható A. anyagot kapunk. Az A. anyag összetételét a következő módon határozzuk meg: az aminosav- és aminocukor-komponenst autoanalizátor (Technikon típus) segítségével határozzuk meg 6N sósavval llOCT-on végzett teljes hidrolízis után 18 illetve 6 órás hidrolízis-idő mellett, a nem-amino-cukrokat 2N sósavval 2 órán át HOC0-on végzett hidrolízis után kvalitatíve papírkromatográfiával (Whatman No.l, oldószer: butanol-piridin-víz 6-4-3 térfogatarányban), kvantitative cukor-autoanalizátor segítségével gázfázisú kromatográfíával határozzuk meg metilezés és szililezés után, Hewlett-Packard kromatográf alkalmazásával, a lipidek meghatározását szilikagél-vékonyréteg-kromatográfiával végezzük teljes hidrolízis és éteres extrakció után. A fentiek szerint előállított vízoldható A. anyag az alábbi tulajdonságokkal jellemezhető: megjelenés: laza sárga por, összetétel: a) aminosav (mólarány): alanin (3), glutaminsav (2), alfa,alfa’-diaminopimelinsav (2), b) aminocukrok (mólarány) N-acetil-glukózamin (2), N-acetil-muraminsav (2), c) redukáló nem-amino-cukrok: mannóz, glukóz, arabinóz jelen van, galaktóz nincs jelen, d) lipidek nincsenek jelen, az aminosavak koncentrációja 31 ± 5%, az aminocukor-koncentrációja 25 ±5% és a maradékot redukáló nem-aminocukrok (11%), valamint az acetileződés révén a redukáló aminocukrokhoz illetve nem-amino-cukrokhoz kötődő acetil-csoportok alkotják, molekulasúly (a molekulánként! 3 alanin-maradék alapján számítva): 4000 ± 200, ülepedési együttható: 0,7. 3. példa 20 g baktérium-tömeget (amelyet a Mycobacterium tuberculosis var. hominis Test törzséből - beszerezhető a párizsi Pasteur Intézetből - kiindulva állítottuk elő) 250 cm3 piridinben 36 órán át 28 C°-on kevertetünk. Ezután 2500 cm3 etanolt adagolunk, és a kevertetést egy éjjelen át folytatjuk. Az oldhatatlan részt, amelyet centrifugálással elkülönítünk, 100 cm3 vízben homogenizátor segítségével (Ultra-Turrax) homogenizáljuk. 48 órán át 40 C°-on való kevertetés és 30 percen át 4 C°-on (400 ford./perc) való centrifugálás után a felülúszó réteget 80 C°-ra melegítjük. Ezután 40%-os telítettségű oldat előállítására ammóniumszulfátot adagolunk. 12 órán át 4C°-on hagyjuk állni az elegyet, majd 30 percen át centrifugáljuk, így egy P40 jelű csapadékot kapunk. A felülúszó folyadékhoz ammóniumszulfátot adagolunk 70%-os telítettségű oldat előállítására. 12 órai állás után (4C°-on) és 30 perces, a fentivel azonos körülmények között végzett centrifugálás után egy P70 jelű csapadékot kapunk. A P40, P70 csapadékot és az utódára előállított felülúszó réteget (S70) a továbbiakban külön-külön dializáljuk desztillált vízzel szemben. A dializálás után visszamaradó különböző oldatokat liofilizáljuk. így egy P40, egy P70 és 0,8 g S70 frakciót kapunk, amely a biológiailag aktív anyagok zömét tartalmazza. Ezt az utóbbi frakciót 0,05 M pH 7 foszfát-pufferrel kiegyensúlyozott DEAE-cellulózon végzett kromatografálással tisztítjuk, az eluálást 0,05 M pH 3 nátriumcitrát-pufferrel végezzük. így a megfelelő frakciók dializálása és liofilizálása után 0,15 g vízoldható B. anyagot és 0,1 g vízoldható C- anyagot kapunk. A C. anyag összetételét a 2. példában leírt módon határozzuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
