172600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható kivonatok előállítására Mycobacteriumokból és ezek immunológiai adjuvásként való alkalmazása
5 172600 6 c) redukáló nem-aminocukrok: arabin óz, galaktóz, mannóz, molekulasúly (a molekulánkénti 3 alanin-maradék alapján számítva): 6000 ± 500. A találmány szerinti eljárás végrehajtása során 5 használható Mycobacteriumok olyan emberi vagy állati eredetű, virulens vagy avirulens törzsek lehetnek, amelyeknél egy „D. viasz” jelenléte kimutatható. Alkalmazható a Mycobacterium tuberculosis var. hominis, Mycobacterium kansasii, 10 Mycobacterium tuberculosis var. bovis LA és BB törzse stb. Bizonyos újabb közlemények (lásd a „D-viasz különböző bovin Mycobacterium törzsekből” c. cikket, J. Bact. 1971. aug., p. 548-550) alapján ismeretessé vált, hogy egyes bovin törzsek 15 „D. viasza” aminosavat nem tartalmaz, ez azonban nem valamennyi törzsre jellemző. A találmány szerinti anyagok a bovin baktérium-törzsek sejtfalából származnak. A találmány szerint előállított vízoldható 20 anyagok adjuváns, nem-artrogén hatással rendelkeznek. Az adjuváns hatékonyságot tengerimalacban (Hartleytörzs) határoztuk meg R.G. White etc. (Immunology, 7, 158, 1964) módszere szerint, az 25 artrogén és a védő hatást pedig a következő módszerekkel: F. Bonhomme, C.R. Acad. Sei., D. sorozat, 263, 1422, 1966 és 265, 2115, 1967. A találmány szerinti „Poly-PA” és az elszappa- 30 nosított vagy acetilezett ,,D. viaszok” összehasonlítása a következőket mutatja: a találmány szerint előállított vízoldható rész (Poly-PA) adjuváns képességgel rendelkezik, de nem artrogén, és nem fejt ki védőhatást egy artrogén 35 „D. viasszal” szemben, az elszappanosítással előállított vízoldható rész rendszerint nem rendelkezik adjuváns képességgel, mivel a cukrok többé-kevésbé módosultak vagy elbomlottak, 40 egy humán eredetű „D. szérum” acetilezése azt megfosztja artrogén képességétől, mimellett gyengítve megmarad az adjuváns képesség, és védőhatás lép fel a továbbiakban bevitt artrogén „D. szérummal” szemben. 45 A találmány szerint előállított vízoldható anyagok tengerimalacban 0,1 mg-nál nagyobb vagy azzal egyenlő intradermális dózisok bevitele esetén az antitestek számának növekedését idézik elő. 50 A találmány szerint előállított új anyagok az ember- vagy állatgyógyászatban a vírus- vagy baktérium-eredetű fertőzésekkel szemben mutatott ellenállás fokozására használhatók. Előidézik a patogén organizmusokkal szemben hatékony anti- 35 testek képződésének fokozódását és bevitelük összekapcsolható vakcinák beadásával, az antitest-reakció maximumának biztosítására. Ezekben a készítményekben a találmány szerint előállított termék koncentrációja általában 0,1%-nál nagyobb. Ezek a készítmények orális, rektális, parenterális úton vagy aeroszol alakjában használhatók. A humán terápiában a dózis a kívánt hatás függvénye, 10-50 mg/nap között helyezkedhet el felnőttek esetében. A következő, nem korlátozó jelleggel megadott példák a találmány szerinti vízoldható anyagok előállítását mutatják be. 1. példa 100 g baktérium-tömeget, amelyet a Pörtogén Mycobacterium tuberculosis var. hominis Peurois törzsből kiindulva — beszerezhető a párizsi Pasteur Intézetből — A. Aebi etc. módszere szerint állítottunk elő, 500 cm3 vízben homogenizátor (Ultra-Turrax) segítségével felaprítunk és homogenizálunk. 5 órán át 20 C°-on kevertetjük az elegyet, majd 30 percig 4 C°-on (4000 ford/perc) centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot 80 C°-ra melegítjük, és 40%-os telítettségű oldat előállítására 12 órán át 4C°-on hagyjuk állni a reakcióelegyet, majd 30 percen át centrifugáljuk. így egy P40 jelű csapadékot kapunk. A felülúszó réteghez ammóniumszulfátot adunk oly módon, hogy 70%-os telítettségű oldatot kapunk. 12 órás állás után (4C°-on) és 30 perces centrifugálás után a fentiekkel azonos körülmények között egy P70 jelű csapadékot kapunk. A P40, P70 csapadékot, valamint az utoljára kapott felülúszó folyadékot (S70) a továbbiakban külön-külön dializáljuk, desztillált vízzel szemben. A diazilálás után visszamaradó különböző oldatokat liofilizáljuk. így 1,2 g P40 frakciót, 1,4 g P70 frakciót és 0,9 g S70 frakciót kapunk, amely a biológiailag aktív anyag nagy hányadát tartalmazza. Ezt az utóbbi frakciót 0,05 M pH 7 foszfát-pufferrel egyensúlyba hozott DEAE-cellulózon való kromatografálással tisztítjuk, az eluálást 0,05 M pH 3 nátriumcitrát-pufferrel végezzük. így 400 mg tisztított Poly-PA-t kapunk. Biogel P10-en való szűrés és vízzel való eluálás után 150 mg nagytisztaságú Poly-PA-t kapunk. A kapott Poly-PA összetételét a következőképpen határozzuk meg: az aminosav- és aminocukor-komponenst autoanalizátor (Technikon típus) segítségével határozzuk meg 6N sósavval 110C°-on 18 illetve 6 órán át végzett teljes hidrolízis után, Gyógyászati készítmények legalább egy, a 60 találmány szerinti eQárással előállított vízoldható anyagot, egy vagy több kompatibilis hígítót vagy adjuvánst és adott esetben más gyógyszereket, például antibiotikumokat, lipideket, pangást megszüntető anyagokat és vakcinákat tartalmaznak. 65 A semleges nem-amino-cukor mennyiségét 2N sósavval 2 órán át 110 C°-on végzett hidrolízis után kvalitatíve papírkromatográfiával (Whatman No.l, oldószer: butanol-pirkün-víz 6—4—3 térfogatarányban), kvantitatíve pedig cukor-autoanalizátorral (Technikon típus) határozzuk meg, 3
