172600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható kivonatok előállítására Mycobacteriumokból és ezek immunológiai adjuvásként való alkalmazása
3 172600 4 A 2 139 610 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat eljárást ismertet, tuberkolózis elleni immunizáló vakcinák előállítására. Mikroorganizmus-tenyészetből nyert antigéneket tisztítanak majd hidrolizálnak, és a kapott, legalább részben hidrolizált antigéneket kis mólsúlyú alkohollal és katalizátorral, szobahőmérsékleten vagy az alatti hőfokon észterezik, majd elválasztják az észterezett antigéneket. Az így kapott anyag alacsony mólsúlyú, de nincs utalás az anyagban levő aminosavakra vonatkozóan. Kiindulási anyagként például M. tuberculosis törzsekből enzimmel, például tripszinnel kivont antigéneket használnak. A találmány szerint ugyan ugyancsak használhatunk kis mólsúlyú alkoholt, például etanolt, azonban csak extrahálásra. Amikor a baktérium-maradékokat piridinnel kezeljük, az elegy alkoholban oldhatatlan részét dolgozzuk fel vizes közegben. Ugyancsak nem tesz említést a fenti nyilvánosságrahozatali irat a piridin jelenlétében végzett acetilezésről sem. A Biochim. Biophys. Acta 1968, 158 (1), 144-146 cikke a poliszacharid-rész méretének befolyását vizsgálja Mycobacteriumok peptidoglikolipidjeinek adjuváns hatására. Kimutatja, hogy a D-viasz hidrolízisével kapott bizonyos poliszacharid-részek befolyással vannak a D-viasz adjuváns hatására. Nem tesz említést a cikk Mycobactenumok vízben oldható kivonatainak előállításáról enyhe extrakcióval, vagy piridinnel való kezelés útján, savanhidrid jelenlétében vagy anélkül. A találmány szerinti eljárással előállított termékek vízoldható kivonatok, amelyek molekulasúlyukkal, aminosav-, aminocukor-, redukáló nem-amino-cukor- és lipid-tartalmukkal, és ülepedési állandójukkal jellemezhetők. A találmány szerinti vízoldható kivonatok olyan anyagokat tartalmaznak, amelyek molekulasúlya 3500 és 30000 között mozoghat. Valamennyi ilyen anyagra jellemző az, hogy egy nitrogén-tartalmú rész (amelynek szerkezete a sejtfal peptidoglukánjához hasonlítható) redukáló nem-amino cukrokhoz kapcsolódik, mint amilyen a mannóz, glukóz, galaktóz és arabinóz. Ezek az anyagok lipid-mentesített Mycobacterium-maradékokból kiindulva állíthatók elő, amely baktérium-maradékokat A. Aebi etc. módszerével (Bull. Soc. Chim. Bioi. 35, 661, 1953) készítünk el, a következő eljárások valamelyikével: a) Enyhe extrakció (homogenizálás vizes közegben), amelyet szokásosan használt fiziko-kémiai elkülönítési és tisztítási módszerek alkalmazása követ (ilyen például a derítés egy só, például ammóniumszulfát segítségével, centrifugálás, dialízis és kromatografálás), b) reagáltatás piridinnel, adott esetben ecetsavanhidrid alkalmazásával, amelyet etanolos illetve vizes kezelés, valamint szokásos elkülönítési és tisztítási módszerek alkalmazása (például derítés, centrifugálás, dialízis és kromatografálás) követ. Az a) eljárás azzal az előnnyel jár, hogy egyrészt könnyen hozzáférhető termékeket (lipid-mentesített sejtek) használ fel, másrészt nem teszi szükségessé enzimek hozzáadását a sejtek lízisének végrehajtására. A b) eljárást ecetsavanhidrid jelenlétében úgy végezzük, hogy az elegyhez a reakció befejeztével etanolt adagolunk, az etanolban oldhatatlan frakciót vízzel felvesszük és kromatografálással tisztítjuk. Ecetsavanhidrid távollétében a reakcióelegyet etanollal kezeljük, az alkoholban oldhatatlan frakciót enyhe extrakciónak vetjük alá (homogenizálás vizes közegben), majd egy só például ammóniumszulfát segítségével többször derítést hajtunk végre, ezután centrifugáljuk, dializálunk és kromatografálunk. Az enyhe extrakció egy „Poly-PA”-nak nevezett vízoldható kivonatot szolgáltat, amelynek jellemzői a következők: megjelenés: fehér, széteső por (liofilizálás után), összetétel: a) aminosavak (mólarány): alanin (3), glutaminsav (2), alfa,alfa’-diaminopimelinsav (2), b) aminocukrok (mólarány): N-acetil-glukózamin (2), N-glikolilmuraminsav (2), N-acetil-galaktózamin van jelen, c) redukáló nem-aminocukrok (mólarány): arabinóz, galaktóz, mannóz jelen van, d) lipidek: 0,5%-nál kisebb mennyiségben, molekulasúly (a molekulánkénti 3 alanin-maradék alapján számítva): 14000 ± 2000, ülepedési állandó, S20 (Beckman készülékkel meghatározva): 2. A piridines kezelés, ecetsavanhidrid jelenlétében egy vízoldható anyagot szolgáltat, amelyet „A. anyagnak” nevezünk, és amelynek jellemzői a következők: megjelenése: sárga, laza por (liofilizálás után), összetétele: a) aminosavak (mólarány): alanin (3), glutaminsav (2), alfa ,alfa’-diaminopimelinsav (2), b) aminocukrok (mólarány): N-acetil-glukózamin (2), N-acetil-muraminsav (2), c) redukáló nem-aminocukrok: mannóz, glukóz, arabinóz jelen van, galaktóz nincs jelen, d) lipidek nincsenek jelen, molekulasúly (a molekulánkénti 3 alanin-maradék alapján számítva): 4000 ± 200, ülepedési állandó, S20 (Beckman-készülékkel meghatározva): 0,7. A kizárólag piridinnel végzett kezelés 2 vízoldható anyagot szolgáltat: az egyik molekulasúlya magas (26500 ± 500), ezt „B. anyagnak” nevezzük, a másik alacsony molekulasúlyú, ezt „C. anyagnak” nevezzük. A C. anyag a következő jellemzőket mutatja: megjelenése: fehér por liofilizálás után, összetétel: a) aminosav (mólarány): alanin (3), glutaminsav (2), alfa^lfa’-diaminopimelinsav (2), b) aminocukrok (mólarány): N-acetil-glukózamin (2), N-glikolil-muraminsav (2), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
